Saber cuántas células vivas tiene y qué tan rápido se dividen es crítico para experimentos reproducibles de cultivo celular y farmacología.

Recuento con Hemocitómetro

El hemocitómetro es un portaobjetos de microscopio especializado con dos cámaras de recuento grabadas, cada una con una rejilla de dimensiones conocidas. La rejilla consiste en nueve cuadrados de 1 × 1 mm, cada uno subdividido en 16 cuadrados más pequeños. La profundidad es de 0.1 mm, dando un volumen de 0.1 µL por cuadrado de 1 mm².

1. Mezcle la suspensión celular thoroughly para asegurar células individuales.
2. Mezcle 10 µL de suspensión celular con 10 µL de azul tripán al 0.4% (para viabilidad).
3. Cargue 10 µL de la mezcla en la cámara del hemocitómetro.
4. Cuente las células en los cuatro cuadrados de 1 mm² de las esquinas (al menos 100 células en total para significación estadística).
5. Calcule: células/mL = (recuento promedio por cuadrado) × factor de dilución × 10⁴.

Exclusión con Azul Tripán

El azul tripán es excluido por células vivas con membranas intactas pero entra en células muertas, tiñéndolas de azul. Viabilidad = (células vivas / células totales) × 100%. La viabilidad aceptable para la mayoría de experimentos es >90%.

Contadores Celulares Automatizados

Los contadores automatizados (Countess, Vi-CELL, Cellometer) usan azul tripán y análisis de imagen digital para contar cientos de células en segundos. Reducen la variabilidad entre operadores y proporcionan datos de distribución de tamaños. La mayoría también calcula la viabilidad y puede detectar grumos celulares. Calibre los contadores automatizados contra recuentos manuales con hemocitómetro periódicamente.

Ensayos de Viabilidad y Citotoxicidad

Más allá del azul tripán, varios ensayos en placa evalúan la viabilidad y citotoxicidad en formatos multi-pocillo:

• Ensayo MTT/MTS: las deshidrogenasas mitocondriales en células vivas reducen el colorante de tetrazolio a formazán coloreado (absorbancia a 490–570 nm). La señal es proporcional al número de células metabólicamente activas.
• Resazurina (Alamar Blue): las células vivas reducen la resazurina a resorufina fluorescente. No tóxico — las mismas células pueden medirse a lo largo del tiempo.
• Ensayo de liberación de LDH: la lactato deshidrogenasa liberada de células dañadas al medio se mide enzimáticamente (absorbancia a 490 nm). Mide directamente la citotoxicidad.
• Ensayo de ATP (CellTiter-Glo): medición basada en luciferasa del ATP celular. Extremadamente sensible y lineal en un amplio rango dinámico.

Ensayos de Proliferación

• Curva de crecimiento: cuente células diariamente durante 5–7 días y grafique el log del número de células vs. tiempo. El tiempo de duplicación se calcula a partir de la fase exponencial.
• Incorporación de BrdU/EdU: análogos de nucleósidos incorporados en el ADN durante la fase S se detectan por tinción con anticuerpos (BrdU) o química click (EdU). Medido por citometría de flujo, microscopía de fluorescencia o ELISA.
• Ensayo SRB (sulforhodamine B): tiñe proteína celular. Las células fijadas se tiñen con SRB, y el colorante unido se solubiliza y mide a 510 nm. Excelente linealidad y estabilidad.