El análisis del ciclo celular cuantifica la proporción de células en cada fase del ciclo de división celular. Los métodos más comunes miden el contenido de ADN por citometría de flujo.

Análisis de Contenido de ADN por Citometría de Flujo

Las células se fijan y permeabilizan, luego se tiñen con un colorante de ADN estequiométrico. La intensidad de fluorescencia es proporcional al contenido de ADN:

• G0/G1: contenido de ADN diploide (2N).
• Fase S: contenido de ADN entre 2N y 4N (síntesis de ADN en curso).
• G2/M: contenido de ADN tetraploide (4N).

El supuesto clave es que el colorante se une al ADN en proporción directa a la masa. El yoduro de propidio (PI) es el colorante de ADN más común para células fijadas, pero también se une al ARN. Por lo tanto, un paso de tratamiento con RNasa A o RNasa T1 es esencial.

Protocolo con yoduro de propidio:

1. Cosechar 1×10⁶ células y lavar con PBS.
2. Fijar en etanol al 70% a −20 °C durante al menos 2 horas (se puede almacenar durante semanas).
3. Lavar con PBS para eliminar el etanol (agitar durante el lavado para evitar grumos).
4. Resuspender en tampón de tinción PI/RNasa (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNasa A en PBS, 0.1% Triton X-100).
5. Incubar a 37 °C durante 30 minutos en oscuridad.
6. Analizar por citometría de flujo (escala lineal, excitación 488 nm, emisión >575 nm).
7. Recoger al menos 10,000 eventos a baja velocidad de flujo para mejor CV.

Análisis de Datos

El histograma de contenido de ADN muestra picos en 2N y 4N con una meseta de fase S entre ellos. El software de modelado (FlowJo, ModFit, FCS Express) ajusta un modelo matemático a los datos:

• Los picos G0/G1 y G2/M se modelan como distribuciones gaussianas (CV = 2–5% para datos de alta calidad).
• La fase S se modela como un rectángulo ancho o polinomio con pendiente creciente de 2N a 4N.
• Los residuos y agregados se modelan mediante una curva de residuos (exponencial) y picos de agregados (en 6N, 8N, etc.).

Un CV >8% en el pico G0/G1 indica datos de mala calidad, grumos celulares, tratamiento incompleto con RNasa o velocidad de flujo demasiado alta.

Incorporación de BrdU

La bromodesoxiuridina (BrdU) es un análogo de timidina incorporado al ADN durante la fase S. Después del marcaje (30–60 minutos), las células se fijan, permeabilizan y tiñen con un anticuerpo anti-BrdU. El ADN se contratiñe con 7-AAD o DAPI. La citometría de flujo con análisis de doble parámetro (BrdU vs. contenido de ADN) resuelve:

• G0/G1: BrdU bajo, ADN 2N.
• Fase S: BrdU alto, ADN intermedio.
• G2/M: BrdU bajo, ADN 4N.
• G0: BrdU muy bajo, ADN 2N (G0 prolongado se distingue de G1 por tinción Ki-67).

La tinción de BrdU requiere desnaturalización parcial del ADN (HCl o DNasa I) para exponer la BrdU incorporada al anticuerpo, lo que degrada la integridad del ADN y puede ensanchar el histograma de contenido de ADN. EdU, un análogo de BrdU detectado por química click catalizada por cobre, evita el paso de desnaturalización y preserva el análisis de contenido de ADN de alta calidad.

Índice Mitótico

Las células en mitosis (fase M) se pueden identificar mediante tinción de histona H3 fosforilada en Ser10 (p-H3S10). Esta modificación es específica de células mitóticas. Combinado con el análisis de contenido de ADN, la tinción p-H3S10 resuelve las células mitóticas de la población más amplia de G2/M.

Problemas Comunes

• Dobletes: dos células G1 que pasan juntas por el láser se registran como un solo evento G2/M. Use una puerta de discriminación de dobletes (FL2-A vs. FL2-W) para excluirlos.
• Población hipodiploide (sub-G1): células con contenido de ADN <2N son apoptóticas o necróticas. Si >10% de los eventos son sub-G1, las condiciones de cultivo pueden estar induciendo muerte celular.
• Fijación: la fijación con metanol proporciona mejor resolución del contenido de ADN que el etanol pero no es compatible con todos los marcadores de superficie celular.