La sincronización celular es el proceso de llevar todas las células de un cultivo a la misma fase del ciclo celular. Permite estudios dependientes del ciclo celular sin métodos de resolución unicelular.

Métodos Químicos

Bloqueo con timidina. El exceso de timidina (2 mM) inhibe la ribonucleótido reductasa, agotando el pool de dCTP y deteniendo la síntesis de ADN. Las células se acumulan en el límite G1/S. Un bloqueo único detiene la mayoría de las células en G1/S en 12–24 horas. Un doble bloqueo con timidina (bloqueo 16–18 horas, liberación 8–10 horas, bloqueo nuevamente 16–18 horas) logra >90% de sincronización en G1/S. El segundo bloqueo atrapa las células que pasaron por la fase S durante la primera liberación.

La liberación se realiza lavando la timidina con medio fresco. Después de la liberación, la población avanza sincrónicamente a través de las fases S, G2 y M. La sincronía se degrada con cada ciclo celular debido a la variación natural en las tasas de progresión del ciclo celular.

Hidroxiurea. Inhibe la ribonucleótido reductasa de manera similar a la timidina. Se usa a 1–2 mM durante 12–24 horas. La hidroxiurea es menos tóxica que la timidina y detiene las células en el límite G1/S con buena reversibilidad. La principal desventaja es que causa daño en el ADN (estrés replicativo), lo que puede confundir experimentos que estudian respuestas al daño del ADN.

Nocodazol. Despolimeriza los microtúbulos, deteniendo las células en fase M en el punto de control de metafase-anafase (punto de control del huso). Se usa a 50–100 ng/mL durante 12–18 horas. El índice mitótico puede alcanzar >90%. Las células mitóticas se redondean y se desprenden de la superficie de cultivo, pueden recolectarse por agitación sin tripsinización, un método llamado agitación mitótica. La liberación es rápida (las células salen de mitosis en 30–60 minutos después del lavado) pero la detención es tóxica si se prolonga más de 18 horas.

Colchicina. Mecanismo similar al nocodazol pero más tóxico y menos reversible. Se usa a 50–100 ng/mL. La colchicina se usa más comúnmente para preparaciones citogenéticas (extensión cromosómica) que para ensayos funcionales.

Mimosina. Un aminoácido vegetal que inhibe el inicio de la replicación del ADN, deteniendo las células en G1 tardía (no en G1/S). Se usa a 0.5–2 mM durante 12–24 horas. La mimosina se usa menos comúnmente que la timidina pero tiene la ventaja de detener en G1 en lugar de en el límite G1/S, lo que es útil para estudiar eventos tempranos de G1.

Privación de Suero

La eliminación del suero del medio de cultivo durante 24–72 horas lleva a las células a G0 (quiescencia). Al añadir suero nuevamente, las células reingresan al ciclo celular en G1. El método es simple y ampliamente utilizado para células primarias y fibroblastos. La eficiencia de sincronización en G0/G1 varía según el tipo celular, las células HEK 293 no se ven muy afectadas por la privación de suero, mientras que las células NIH 3T3 se detienen efectivamente.

La privación de suero causa cambios globales en el metabolismo, señalización (mTOR, MAPK) y expresión génica que no se limitan a la detención del ciclo celular. No debe usarse para experimentos donde las líneas base metabólicas o de señalización sean críticas.

Métodos Físicos

Agitación mitótica. Durante el bloqueo con nocodazol o incluso en crecimiento logarítmico, las células mitóticas se redondean y se desprenden. Golpear suavemente el frasco de cultivo las desprende al medio. Las células recolectadas son >95% mitóticas y pueden replantearse para progresión sincrónica a G1. El rendimiento es bajo (1–3% de la población) y el método solo funciona para células adherentes.

Elutriación centrífuga. Las células se separan por tamaño en una centrífuga de contraflujo, las células grandes (G2/M) sedimentan más rápido, las células pequeñas (G1) eluyen primero. El método requiere equipo especializado (Beckman JE-5.0 o similar) pero produce poblaciones sincrónicas sin perturbación química. Funciona tanto para células adherentes como en suspensión y puede producir 10⁸–10⁹ células sincronizadas por carrera.

Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células teñidas con un colorante de ADN vital (Hoechst 33342) se clasifican en poblaciones G1, S y G2/M. El método produce poblaciones altamente puras (>99%) pero el proceso de clasificación es estresante y el rendimiento es bajo (10⁶–10⁷ células por hora).

Verificación

La eficiencia de sincronización debe verificarse, típicamente mediante análisis del ciclo celular usando tinción de ADN con yoduro de propidio y citometría de flujo. La fracción de células en la fase objetivo debe ser >80–90% para una sincronización exitosa. Para sincronización mitótica, se usa tinción de p-H3S10.

Selección de un Método

Los métodos químicos son los más accesibles pero pueden introducir artefactos. Los métodos físicos evitan productos químicos pero requieren equipo especializado o producen menos células.