La microscopía confocal de barrido láser (CLSM) es una técnica de imagen óptica que mejora la resolución y el contraste al eliminar la luz desenfocada. Un orificio (pinhole) colocado frente al detector bloquea la luz de planos por encima y por debajo del plano focal, por lo que solo la luz del punto focal llega al detector. Esta capacidad de seccionamiento óptico permite la obtención de imágenes de especímenes gruesos y la reconstrucción tridimensional.
En un microscopio confocal, un haz láser se expande y se dirige a través del objetivo hasta un punto limitado por difracción en el espécimen. Las moléculas fluorescentes en el volumen focal se excitan y emiten luz que es recogida por el mismo objetivo. Un espejo dicroico separa las rutas de excitación y emisión, y un orificio variable en el plano de imagen conjugado rechaza la emisión desenfocada. Un tubo fotomultiplicador o un fotodiodo de avalancha detecta la señal.
El haz se barre en raster a través del espécimen utilizando espejos galvanométricos, construyendo la imagen píxel por píxel. La velocidad de barrido típicamente varía de 0.5 a 4 fotogramas por segundo a 512×512 píxeles. Los escáneres resonantes logran imágenes a velocidad de video para aplicaciones de células vivas.
La resolución lateral de la microscopía confocal es de aproximadamente 0.2 µm, y la resolución axial es de aproximadamente 0.5 µm con objetivos de alta apertura numérica. La resolución depende de la longitud de onda de excitación y la apertura numérica del objetivo. El diámetro del orificio se ajusta a 0.5-1 unidad Airy para equilibrar la resolución y la intensidad de la señal.
La imagen multicanal excita secuencialmente múltiples fluoróforos utilizando diferentes líneas láser y detecta la emisión a través de detectores separados o canales espectrales. Los fluoróforos comunes incluyen DAPI, FITC, TRITC, Cy3, Cy5 y colorantes Alexa. La separación espectral discrimina espectros de emisión superpuestos.
La adquisición de pilas Z recoge una serie de secciones ópticas a diferentes profundidades focales. La proyección de máxima intensidad y el renderizado de volumen reconstruyen estructuras tridimensionales. La imagen de lapso de tiempo captura procesos dinámicos en especímenes vivos. FRAP (recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo) mide la movilidad molecular. La fotoactivación y la fotoconversión rastrean subpoblaciones específicas.
Las aplicaciones abarcan la biología celular, la neurobiología, la biología del desarrollo y la ciencia de materiales. CLSM obtiene imágenes de la organización del citoesqueleto, la señalización intracelular, la dinámica de membranas y la localización subcelular en células fijas y vivas. En ciencia de materiales, CLSM caracteriza la topografía superficial, el espesor de recubrimientos y la distribución de partículas.
