Mientras que CRISPR/Cas9 se usa para editar genes individuales, el cribado CRISPR escala la ingeniería genómica a todo el genoma en un solo experimento, identificando genes que confieren resistencia, sensibilidad o un fenotipo específico.

Principio

Un cribado CRISPR agrupado utiliza una biblioteca de secuencias de ARN guía único (sgRNA) que se dirigen a cada gen del genoma (o un subconjunto enfocado). Cada sgRNA dirige a Cas9 para crear una rotura de doble cadena en un locus genómico específico, produciendo un knockout. Al rastrear qué sgRNAs se enriquecen o empobrecen en una población bajo selección, el cribado identifica genes funcionalmente relevantes.

Diseño de la Biblioteca

Las bibliotecas CRISPR genómicas (Brunello, TKOv3, GeCKO) contienen 4–6 sgRNAs por gen, más 100–1000 controles no dirigidos. Cada sgRNA es una secuencia de 20 nt que se dirige a un sitio adyacente a PAM en el genoma. La biblioteca se sintetiza como un grupo de oligonucleótidos, se clona en un vector lentiviral y se empaqueta en lentivirus.

Flujo de Trabajo del Cribado

1. Transducción: infectar células que expresan Cas9 con la biblioteca lentiviral de sgRNA a baja multiplicidad de infección (MOI ~0.3) para que la mayoría de las células reciban un solo sgRNA. Usar suficientes células para mantener una representación ~500× de cada sgRNA.
2. Selección: 48 horas después de la transducción, añadir puromicina (u otro antibiótico de selección) para seleccionar células que han integrado la biblioteca.
3. Selección fenotípica: después de 7–14 días de propagación, aplicar la condición experimental: tratamiento farmacológico, exposición a toxinas, inanición, o clasificar células según un reportero. Una población de control paralela se cultiva sin selección.
4. Secuenciación: extraer ADN genómico de ambas poblaciones, amplificar por PCR la región codificante de sgRNA y secuenciar en una plataforma Illumina.
5. Análisis: alinear las lecturas con la referencia de la biblioteca, contar sgRNAs por gen y calcular el cambio de pliegue entre poblaciones seleccionadas y control. Los genes con sgRNAs significativamente empobrecidos son esenciales para la supervivencia; los sgRNAs enriquecidos indican genes de resistencia.

Consideraciones Clave

• Representación: mantener al menos 500 células por sgRNA durante todo el cribado para evitar artefactos de pérdida.
• Expresión de Cas9: las células deben expresar Cas9 en altos niveles. Se prefieren líneas estables que expresan Cas9 o líneas con knock-in de Cas9.
• Controles: incluir un control de toxicidad (p. ej., una dosis alta del fármaco) para confirmar que el empobrecimiento es específico, y un control sin selección para contabilizar los efectos de crecimiento de los propios sgRNAs.

Aplicaciones

Los cribados CRISPR se han utilizado para identificar mecanismos de resistencia a quimioterapéuticos, terapias dirigidas e inmunoterapias; descubrir factores del huésped requeridos para la infección viral; mapear interacciones letales sintéticas en cáncer; e identificar genes que regulan la diferenciación, migración y metabolismo celular.

Comparación con Cribados de shRNA

Los cribados CRISPR crean knockouts completos (mutaciones de cambio de marco) en lugar de knockdowns (degradación de ARNm), dando una pérdida de función más consistente y completa. Tienen menos efectos fuera del objetivo que shRNA debido a la secuencia diana más larga (20 nt vs. 19 nt) y el requisito de una secuencia PAM. Sin embargo, los cribados CRISPR se limitan a genes codificantes de proteínas, mientras que los cribados de shRNA pueden dirigirse a ARN no codificantes.