La criopreservación es el proceso de preservar células vivas, tejidos o microorganismos a temperaturas ultrabajas (típicamente −80 °C o −196 °C en nitrógeno líquido) para que permanezcan viables para uso futuro. Un banco de células bien gestionado asegura la reproducibilidad experimental durante años.

Principios

La formación de cristales de hielo es la causa principal de muerte celular durante la congelación. El hielo intracelular perfora las membranas y altera los orgánulos. Los agentes crioprotectores (CPA) protegen las células mediante:

• Penetración celular (ej., DMSO, glicerol) para desplazar el agua y reducir el punto de congelación.
• No penetrantes (ej., sacarosa, Ficoll) para deshidratar las células antes de la congelación.

La velocidad de enfriamiento debe equilibrar dos efectos competitivos: demasiado lenta causa daño osmótico por exposición prolongada a solutos concentrados; demasiado rápida causa hielo intracelular letal. La mayoría de las células de mamífero se enfrían óptimamente a −1 °C por minuto.

Crioprotectores

• DMSO (dimetilsulfóxido): el CPA más utilizado. La concentración típica es 5–10% (v/v) en medio de cultivo con 10–20% de FBS o medio de congelación sin suero. El DMSO es tóxico para las células a temperatura ambiente con el tiempo — trabaje rápidamente y mantenga las células en hielo.
• Glicerol: 10–20% (v/v). Menos tóxico que el DMSO pero menos penetrante. Comúnmente usado para bacterias, levaduras y algunas líneas celulares.
• Medios de congelación sin suero: formulaciones comerciales (ej., CryoStor, Recovery Cell Culture Freezing Medium) usan CPA definidos sin suero animal.

Protocolo de Congelación

1. Coseche células en fase logarítmica con >90% de viabilidad.
2. Cuente y centrifugue a 200–300 × g durante 5 minutos.
3. Resuspenda en medio de congelación frío a 1–5 × 10⁶ células/mL.
4. Dispense en crioviales (1 mL por vial). Etiquete con línea celular, número de pase, fecha y operador.
5. Enfríe a −1 °C/min usando un congelador de velocidad controlada, un contenedor de congelación con isopropanol (Mr. Frosty) o un dispositivo de enfriamiento pasivo.
6. Transfiera a −80 °C durante 24 horas (corto plazo), luego traslade a nitrógeno líquido (−196 °C) para almacenamiento a largo plazo.

Protocolo de Descongelación

1. Retire el vial del almacenamiento y colóquelo inmediatamente en un baño de agua a 37 °C con agitación suave.
2. Descongele hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo (aproximadamente 1–2 minutos).
3. Limpie el vial con etanol al 70%.
4. Transfiera el contenido gota a gota a 10 mL de medio de cultivo precalentado.
5. Centrifugue a 200 × g durante 5 minutos para eliminar el DMSO, resuspenda en medio fresco y plaque.

Criopreservación de Bacterias y Levaduras

Las bacterias y levaduras son más simples de preservar. Mezcle un cultivo nocturno 1:1 con glicerol estéril al 50% en un criovial, agite y congele a −80 °C. Para recuperación, raspe la superficie del stock congelado con un asa estéril y siembre en una placa de agar — no descongele todo el stock.

Buenas Prácticas de Bancos de Células

• Cree un Banco de Células Maestro (MCB) en el número de pase más bajo posible, luego derive Bancos de Células de Trabajo (WCB) del MCB.
• Analice los MCB para micoplasma, contaminación bacteriana e identidad (perfil STR para líneas celulares humanas).
• Almacene los viales del MCB en dos ubicaciones físicamente separadas.
• Monitoree los niveles de nitrógeno líquido y mantenga un registro de temperatura.