Las proteínas purificadas rara vez están en el tampón exacto requerido para el siguiente paso — ya sea cristalización, ensayos de actividad o formulación. La diálisis, la ultrafiltración y las columnas desaladoras son las herramientas estándar para el intercambio de tampón.
Diálisis
La diálisis utiliza una membrana semipermeable con un corte de peso molecular (MWCO) definido para separar moléculas pequeñas de las más grandes. La muestra de proteína se sella dentro del tubo de diálisis y se coloca en un gran volumen del tampón deseado. Las moléculas pequeñas (sales, agentes reductores, desnaturalizantes) se difunden a través de la membrana hacia el dializado hasta alcanzar el equilibrio.
Selección de MWCO: elija una membrana con un tamaño de poro que sea menos de la mitad del peso molecular de la proteína para asegurar una retención completa. Los valores estándar de MWCO son 3.5, 6–8, 10 y 14 kDa. Para la mayoría de las proteínas, un MWCO de 6–8 kDa o 10 kDa es apropiado.
Protocolo:
- Pre-humedezca la membrana de diálisis en agua destilada o tampón durante 30 minutos.
- Enjuague con el tampón de diálisis.
- Cargue la muestra en el tubo, dejando espacio de aire para cambios de volumen.
- Selle con clips y coloque en 100–200 volúmenes de tampón.
- Agite suavemente a 4 °C. Cambie el tampón 2–3 veces durante 12–24 horas.
- Recupere la muestra — puede haberse diluido ligeramente debido a efectos osmóticos.
Los cassettes Slide-A-Lyzer (Thermo) usan un marco de plástico rígido con una membrana integrada, eliminando la necesidad de manipulación del tubo. Flotan en el tampón y son más fáciles de manejar para volúmenes pequeños.
Ultrafiltración (Concentradores Centrífugos)
Los concentradores centrífugos (Amicon Ultra, Vivaspin) combinan filtración con centrifugación. Una membrana en el fondo de un reservorio de muestra permite el paso de agua y solutos pequeños mientras retiene la proteína sobre la membrana. La centrifugación a 3000–5000 × g fuerza el líquido a través de la membrana.
Concentración: el volumen de la muestra se reduce descartando el filtrado. Procese en centrifugaciones cortas (5–10 minutos) para evitar la sobreconcentración, que puede causar precipitación. Monitoree el volumen del retenido mediante las marcas en el dispositivo.
Intercambio de tampón por diafiltración: en lugar de concentrar hasta sequedad, añada el nuevo tampón al retenido y centrifugue nuevamente. Repita 3–5 veces; cada ciclo intercambia aproximadamente el 90% del tampón. Cinco ciclos logran >99.99% de intercambio.
Selección de MWCO: como en la diálisis, elija un MWCO al menos 2× menor que la proteína. A diferencia de la diálisis, la clasificación de MWCO para concentradores se basa en la retención de proteínas globulares — los polímeros lineales y algunos detergentes pueden pasar a través de una membrana nominalmente retentiva.
Columnas Desaladoras (Exclusión por Tamaño)
Las columnas desaladoras (PD-10, Zeba Spin, NAP-5) utilizan cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) con columnas de pequeñas perlas. La muestra se aplica a la columna, y las moléculas grandes (proteínas) eluyen en el volumen muerto, antes que las moléculas pequeñas (sales, nucleótidos, agentes reductores). La proteína se recolecta en el nuevo tampón sin dilución (PD-10) o con dilución mínima (Zeba).
La desalación es más rápida que la diálisis (5–15 minutos vs. horas) pero está limitada a volúmenes de muestra apropiados para el tamaño de la columna (típicamente 0.5–2.5 mL). Para volúmenes más grandes, se utiliza diálisis o filtración de flujo tangencial.
