Descripción general
La epigenómica es el estudio de las modificaciones epigenéticas en todo el genoma: cambios químicos en el ADN y la cromatina que regulan la expresión genética sin alterar la secuencia de ADN subyacente. Estas modificaciones incluyen la metilación del ADN en dinucleótidos CpG, modificaciones postraduccionales de histonas (como acetilación, metilación y fosforilación) y patrones de accesibilidad a la cromatina. Los mapas epigenómicos varían según los tipos de células, las etapas de desarrollo y los estados patológicos, lo que proporciona una capa dinámica de información que complementa el genoma estático. Proyectos a gran escala como los consorcios ENCODE y Roadmap Epigenomics han producido atlas epigenómicos completos para cientos de tipos de células humanas.
Métodos
La elaboración de perfiles epigenómicos se basa en técnicas adaptadas para la secuenciación de alto rendimiento. La secuenciación con bisulfito del genoma completo (WGBS) convierte las citosinas no metiladas en uracilo, lo que permite mapas de metilación con resolución de base única. ChIP-seq utiliza anticuerpos para inmunoprecipitar modificaciones de histonas específicas o regiones unidas a factores de transcripción, seguido de secuenciación. ATAC-seq y DNase-seq mapean regiones de cromatina abiertas para identificar elementos reguladores activos. Hi-C y métodos relacionados capturan la conformación de la cromatina tridimensional. Los canales de bioinformática procesan lecturas sin procesar mediante alineación, llamadas de picos (usando MACS2 o PeakDene) y análisis de enriquecimiento diferencial. El análisis integrador que combina múltiples pistas epigenómicas revela estados de cromatina, como promotores activos, potenciadores y regiones reprimidas, utilizando herramientas como ChromHMM.
Aplicaciones
La epigenómica ha transformado nuestra comprensión del desarrollo, el envejecimiento y las enfermedades. Los patrones aberrantes de metilación del ADN son características del cáncer, y el silenciamiento del gen supresor de tumores mediante la hipermetilación del promotor es ahora un objetivo terapéutico. El perfil epigenómico guía el descubrimiento de potenciadores y otros elementos reguladores estudiados en regulación genética y epigenética. La técnica está estrechamente relacionada con la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) pero está ampliada a todo el genoma. La epigenómica también ilustra cómo el tiempo de replicación del ADN se correlaciona con el estado de la cromatina, y cómo las exposiciones ambientales dejan marcas epigenéticas duraderas que influyen en los resultados de salud a lo largo de la vida.
Protocolo práctico
Para la secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS), comience con 100 a 500 ng de ADN genómico enriquecido con 0,5% de ADN del fago lambda no metilado como control de conversión. Fragmente el ADN mediante sonicación a 200–400 pb, luego realice la reparación del extremo, la cola A y la ligadura del adaptador. Trate con bisulfito de sodio utilizando el kit EZ DNA Mmethylation-Gold, que convierte las citosinas no metiladas en uracilo y deja intactas las citosinas metiladas. Amplifique por PCR (12 ciclos) con polimerasa tolerante a uracilo (por ejemplo, PfuTurbo Cx) y secuencia de extremos emparejados de 150 pb. Alinear las lecturas con Bismark: bismark --genome genome_dir -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o bismark_output. Elimine lecturas duplicadas con deduplicate_bismark. Extraiga llamadas de metilación: bismark_methylation_extractor --gzip --bedGraph --counts --buffer_size 10G bismark_output.bam. El resultado incluye porcentajes de metilación por CpG en un archivo de informe bedGraph o CX. Para el análisis de metilación diferencial, utilice methylKit en R: methRead para importar archivos de cobertura, calculateDiffMeth para identificar citosinas o regiones metiladas diferencialmente con valor q <0,05 y diferencia de metilación> 25 %. Para el análisis de modificación de histonas de ENCODE ChIP-seq, procese lecturas sin procesar a través del canal ENCODE: alinee con Bowtie2, filtre duplicados, llame a picos con MACS2 usando el modo --broad para H3K27me3 o H3K36me3 y genere pistas de señal con bedClip y bedGraphToBigWig. La segmentación del estado de cromatina con ChromHMM combina múltiples marcas de histonas (H3K4me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K36me3, H3K27me3) en un modelo combinatorio: java -jar ChromHMM.jar LearnModel -b 200 binarized_beds output_dir 15 hg38. El modelo de 15 estados segmenta el genoma en promotores activos, potenciadores, regiones transcritas, dominios Polycomb reprimidos y heterocromatina.
