La hibridación fluorescente in situ utiliza sondas de ADN marcadas fluorescentemente para detectar y localizar secuencias específicas de ADN en cromosomas metafásicos y núcleos en interfase, permitiendo la visualización directa de la organización genómica y anomalías.
Principio
La FISH sigue los mismos principios de hibridación que la hibridación in situ colorimétrica, pero utiliza sondas conjugadas con fluoróforos para detección directa sin amplificación enzimática. Las señales fluorescentes se visualizan mediante microscopía de epifluorescencia o confocal. Múltiples sondas con fluoróforos distintos pueden aplicarse simultáneamente, permitiendo el análisis multicolor de varios loci genómicos en un solo espécimen.
Tipos de Sonda
Las sondas específicas de locus se dirigen a regiones genómicas únicas, típicamente de 50–500 kb clonadas en BAC o fosmidos. Se marcan mediante nick translation con nucleótidos fluorescentes como SpectrumOrange, SpectrumGreen o Cy5. Las sondas centroméricas se dirigen a secuencias repetitivas de satélite alfa e identifican cromosomas específicos. Las sondas teloméricas marcan los extremos de los cromosomas. Las sondas de pintura cromosómica completa son mezclas complejas de secuencias únicas de un solo cromosoma, generadas por clasificación de flujo o microdisección. Los conjuntos de sondas basados en oligonucleótidos sintetizados en micromatrices ahora ofrecen cobertura personalizable de alta resolución.
Métodos de Marcaje
El marcaje directo incorpora nucleótidos conjugados con fluoróforos durante la síntesis de la sonda. La detección es inmediata después de la hibridación. El marcaje indirecto incorpora haptenos como digoxigenina o biotina, que se detectan después de la hibridación con anticuerpos conjugados con fluoróforos o estreptavidina. Los métodos indirectos proporcionan amplificación de señal a través de capas de anticuerpos y son útiles para dianas pequeñas. La amplificación de señal por tiramida aumenta aún más la sensibilidad.
Preparación de Muestras
Los extendidos de cromosomas metafásicos se preparan a partir de cultivos celulares detenidos con colcemida, hinchados hipotónicamente y fijados en metanol:ácido acético (3:1). Los núcleos en interfase se obtienen de células no cultivadas o tejidos fijados. Los especímenes se envejecen, se tratan con RNasa y pepsina para reducir el fondo y se deshidratan mediante una serie de etanol. La desnaturalización del ADN diana en formamida al 70% a 72 °C es necesaria para sondas de doble cadena. Los protocolos sin formamida que utilizan desnaturalización por calor en tampón de hibridación son alternativas.
Hibridación y Lavado
La sonda y la diana se co-desnaturalizan a 75 °C durante 5 minutos, luego se hibridan a 37 °C durante 4–16 horas en una cámara humidificada. Los lavados post-hibridación en SSC y Tween-20 eliminan la sonda no unida. La estringencia se controla mediante la concentración de formamida, la temperatura de lavado y la concentración de sales. Después de los lavados, los portaobjetos se contrastan con DAPI, que produce un patrón de bandas Q en cromosomas metafásicos para la identificación del cariotipo.
FISH Multicolor
La FISH múltiplex (M-FISH) utiliza combinaciones de cinco fluoróforos en un esquema de marcaje combinatorio para generar 24 conjuntos de sondas específicas de cromosoma, cada una con una firma espectral única. El cariotipo espectral utiliza un enfoque similar con espectrometría de imágenes. Estas técnicas permiten un análisis completo del cariotipo en un solo experimento, detectando reorganizaciones complejas, cromosomas marcadores y translocaciones crípticas.
Aplicaciones
La FISH es un pilar clínico para la detección de aneuploidías cromosómicas en diagnóstico prenatal utilizando amniocitos no cultivados y muestras de vellosidades coriónicas. El estado de amplificación del gen HER2 en cáncer de mama se evalúa rutinariamente mediante FISH. La detección de la fusión BCR-ABL en la leucemia mieloide crónica utiliza sondas de doble color y doble fusión en núcleos en interfase. El cromosoma Filadelfia t(9;22) aparece como una señal de fusión. La FISH en secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina mapea cambios genómicos en tumores sólidos. Las pinturas específicas de cromosoma son esenciales en biología de la radiación para cuantificar el daño y la reparación del ADN mediante ensayos de micronúcleos y translocaciones.
