Descripción general
La genómica funcional tiene como objetivo cerrar la brecha entre la secuencia del genoma y la función biológica caracterizando sistemáticamente las funciones de los genes, sus productos y sus interacciones a escala de todo el genoma. Mientras que la genómica estructural proporciona el modelo estático del ADN de un organismo, la genómica funcional pregunta qué hace cada elemento, cuándo y dónde está activo y cómo participa en las redes celulares. El campo integra datos de transcriptómica, proteómica y pantallas de perturbaciones de alto rendimiento para asignar una función biológica a cada gen. Esta perspectiva a nivel de sistemas se ha vuelto esencial para comprender fenotipos complejos.
Métodos
Varios enfoques de alto rendimiento impulsan la genómica funcional. Las pruebas de pérdida de función utilizan bibliotecas de ARN de interferencia (RNAi) o CRISPR-Cas9 para eliminar genes sistemáticamente y observar las consecuencias fenotípicas. Las pruebas de ganancia de función sobreexpresan bibliotecas de ADNc para identificar genes que impulsan fenotipos particulares. El mapeo de interacción de proteínas (mediante espectrometría de masas de purificación por afinidad o de dos híbridos de levadura) construye redes de interacción en todo el genoma. El perfil de expresión génica mediante RNA-seq o microarrays revela patrones de coexpresión que sugieren relaciones funcionales. La integración de diversos tipos de datos a través del aprendizaje automático predice la función genética con una precisión cada vez mayor, asignando anotaciones como términos de ontología genética basados en evidencia multiómica.
Aplicaciones
La genómica funcional impulsa el descubrimiento en todos los ámbitos de la vida. En la investigación del cáncer, las pruebas CRISPR identifican genes esenciales para el crecimiento tumoral y genes cuya pérdida confiere resistencia a los medicamentos. En microbiología, los ensayos de aptitud de todo el genoma identifican los genes necesarios para la patogénesis. Las aplicaciones agrícolas incluyen la identificación de genes que controlan el rendimiento, la tolerancia al estrés y el contenido nutricional mediante tecnología de ADN recombinante y detección funcional. El campo continúa evolucionando con tecnologías unicelulares y pantallas CRISPR in vivo que revelan la función genética en contextos de tejido nativo, acercándonos a una anotación funcional completa del genoma.
Protocolo práctico
Para que un experimento ChIP-seq identifique los sitios de unión del factor de transcripción, comience con la reticulación de las células usando formaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego apague con glicina. La cromatina se corta en fragmentos de 200 a 600 pb mediante sonicación (p. ej., Covaris o Diagenode Bioruptor). La inmunoprecipitación utiliza de 2 a 5 µg de anticuerpo específico del objetivo acoplado a perlas magnéticas de proteína A/G durante la noche a 4 °C. Después del lavado, reticule de forma inversa a 65 °C durante 6 horas con proteinasa K y luego purifique el ADN con limpieza de columna. Las bibliotecas se preparan con reparación de extremos, cola A, ligadura de adaptadores y 12 a 15 ciclos de PCR. Secuencia en Illumina con lecturas de 50 pb de un solo extremo. Ejecute la tubería ENCODE ATAC-seq para crear perfiles de cromatina abierta en células congeladas o frescas: los núcleos se aíslan mediante incubación con tampón de lisis y luego se etiquetan con transposasa Tn5 a 37 °C durante 30 minutos: etiqueta --entrada 50000 células --salida etiquetada.bam. Amplifique por PCR con cebadores con código de barras durante 8 a 12 ciclos y secuenciar en pares. Para el análisis de datos, alinee las lecturas con Bowtie2 usando --very-SENSITIVE para ATAC-seq o BWA para ChIP-seq. Elimine duplicados con Picard MarkDuplicates. Llamadas máximas con MACS2: macs2 callpeak -t alineado.bam -c input.bam -f BAMPE -g hs -n sample -q 0.05. Para marcas de histonas como H3K4me3, utilice el modo de pico amplio con --broad. Las métricas de calidad incluyen la fracción de lecturas en picos (FRiP > 1 % para factores de transcripción, > 10 % para marcas de histonas), NSC (coeficiente de cadena normalizado >1,05) y RSC (correlación relativa de cadena >0,8). El análisis de unión diferencial entre condiciones utiliza “DiffBind” en R, y el enriquecimiento de motivos se prueba con “HOMER” o “MEME-ChIP”.
