La cromatografía de interacción hidrofóbica separa proteínas según diferencias en la hidrofobicidad superficial. Las proteínas se cargan en condiciones de alta salinidad que promueven interacciones hidrofóbicas con la fase estacionaria y se eluyen disminuyendo la concentración de sal, lo que debilita el efecto hidrofóbico.
Principio
A altas concentraciones de sal, las moléculas de agua se ordenan alrededor de los iones salinos (efecto de salado), reduciendo la disponibilidad de agua para solvatar parches hidrofóbicos en las superficies proteicas. Esto fuerza a las regiones hidrofóbicas de las proteínas a interactuar con ligandos hidrofóbicos inmovilizados en el medio cromatográfico. A medida que la concentración de sal se reduce durante la elución, el agua se vuelve más disponible, las interacciones hidrofóbicas se debilitan y las proteínas eluyen en orden creciente de hidrofobicidad superficial. La unión depende del tipo y concentración de sal, siendo el sulfato de amonio, el sulfato de sodio y el NaCl opciones comunes dispuestas en la serie de Hofmeister según su fuerza de salado.
Selectividad y Resolución
La selectividad de HIC es ortogonal a la cromatografía de intercambio iónico y a la cromatografía de exclusión por tamaño. La resolución depende del tipo de ligando (alquilo — butilo, octilo, fenilo), la densidad de ligando, la pendiente del gradiente de sal y la temperatura. Los gradientes lineales de 10–20 volúmenes de columna proporcionan típicamente la mejor resolución. La elución escalonada se utiliza para la captura a escala de proceso. Los ligandos fenilo ofrecen interacciones tanto hidrofóbicas como aromáticas, proporcionando una selectividad distinta de los ligandos alquilo de cadena lineal.
Medios de Columna
Las resinas HIC comunes incluyen butil- y octil-Sepharose (GE Healthcare), Phenyl y Butyl Toyopearl (Tosoh), y soportes Macro-Prep t-Butyl y Methyl HIC (Bio-Rad). Las resinas varían en hidrofobicidad: butilo > octilo para cadenas alquilo a densidad equivalente. Los tamaños de partícula de 30–100 µm equilibran la resolución y las propiedades de flujo para trabajo preparativo.
Consideraciones de Tampón
Los tampones de carga contienen sulfato de amonio 1–2 M o NaCl 3–4 M. La elución utiliza el mismo tampón sin sal. La reducción del pH o la inclusión de etilenglicol reducen aún más las interacciones hidrofóbicas para proteínas fuertemente unidas. Los detergentes deben evitarse ya que interfieren con la unión hidrofóbica. Las muestras se ajustan a menudo directamente añadiendo sal sólida o diluyendo con soluciones concentradas de sal.
Desarrollo de Métodos
Comenzar con una columna de cribado pequeña (1 mL) probando dos o tres químicas de resina a dos concentraciones de sal. Cargar 5–10 mg de proteína por mL de resina. Lavar con 5 volúmenes de columna de tampón de carga. Eluir con un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna hasta cero sal. Recoger fracciones de 1 mL y analizar mediante SDS-PAGE. Optimizar la pendiente del gradiente para la separación deseada.
Aplicaciones
La HIC se utiliza ampliamente en la fabricación biofarmacéutica como paso de purificación intermedia o pulido. Elimina eficazmente agregados, isoformas truncadas y proteínas de la célula huésped después de un paso de captura como Proteína A o IMAC. La HIC es particularmente eficaz para eliminar contaminantes hidrofóbicos incluyendo endotoxinas, proteínas unidas a ADN y partículas virales. Se acopla comúnmente con sistemas de FPLC para la ejecución automatizada de métodos.
