La inmunofluorescencia (IF) y la inmunocitoquímica (ICC) son técnicas basadas en anticuerpos que revelan dónde se localiza una proteína dentro de una célula a nivel subcelular. La IF utiliza colorantes fluorescentes; la ICC utiliza enzimas cromogénicas. Ambas son esenciales para la biología celular, patología y descubrimiento de fármacos.

Métodos Directos e Indirectos

IF directa: un anticuerpo primario está directamente conjugado a un fluoróforo. Rápida (una sola incubación) y bajo fondo, pero la amplificación de señal es limitada porque solo un anticuerpo se une por antígeno.

IF indirecta: un anticuerpo primario no conjugado se une a la diana, y un anticuerpo secundario conjugado a fluoróforo se une al primario. La amplificación de señal ocurre porque múltiples anticuerpos secundarios se unen a cada anticuerpo primario. Este es el enfoque más común, ya que funciona con muchos anticuerpos primarios de la misma especie huésped.

Preparación de Muestra

1. Fijación: preserva la estructura celular e inmoviliza los antígenos. Paraformaldehído (PFA al 4%, 15 minutos a temperatura ambiente) es el fijador más común para IF. Entrecruza proteínas mediante grupos amino. La fijación con metanol/acetona es más rápida pero puede distorsionar la morfología y destruir algunos epítopos.
2. Permeabilización: permite que los anticuerpos accedan a antígenos intracelulares. Triton X-100 (0.1–0.5%) o saponina (0.1%, más suave) durante 10–15 minutos. Omita la permeabilización si tiñe solo antígenos de superficie celular.
3. Bloqueo: incube con BSA al 1–5%, suero normal al 5–10% (de la especie huésped del anticuerpo secundario) o tampón de bloqueo comercial durante 30–60 minutos para prevenir la unión inespecífica de anticuerpos.
4. Anticuerpo primario: incube en tampón de bloqueo a 4 °C toda la noche o a temperatura ambiente durante 1–2 horas. Optimice la dilución empíricamente.
5. Lavado: 3 × 5 minutos en PBS.
6. Anticuerpo secundario: incube durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad (los fluoróforos son sensibles a la luz).
7. Lavado: 3 × 5 minutos en PBS.
8. Contratinción y montaje: DAPI o Hoechst 33342 para teñir núcleos (5 minutos). Monte con medio de montaje antifotoblanqueo.

Controles

• Control sin anticuerpo primario: solo anticuerpo secundario — no debe mostrar tinción específica.
• Control de isotipo: anticuerpo primario reemplazado por un anticuerpo no específico del mismo isotipo.
• Control de péptido bloqueante: pre-incube el anticuerpo primario con el péptido inmunizante para abolir la tinción específica.
• Control de eliminación: células que carecen de la proteína diana confirman la especificidad del anticuerpo.

Multiplexado

Se pueden obtener imágenes de múltiples proteínas simultáneamente usando anticuerpos primarios generados en diferentes especies huésped (ratón, conejo, cabra, rata) con anticuerpos secundarios específicos de especie conjugados a fluoróforos distintos (DAPI (azul), Alexa 488 (verde), Alexa 568 (rojo), Alexa 647 (rojo lejano)). La separación espectral o filtros de banda estrecha evitan la superposición entre canales.

Adquisición de Imágenes

Use un microscopio de fluorescencia de campo amplio para muestras o secciones delgadas, un microscopio confocal para muestras más gruesas (el seccionamiento óptico elimina el desenfoque fuera de foco), y un microscopio de iluminación estructurada o STED para imágenes de superresolución por debajo del límite de difracción. Ajuste los tiempos de exposición contra el control sin anticuerpo primario para asegurar que la señal específica esté por encima del fondo.