La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica sin marcaje que mide directamente el cambio de calor que acompaña a una interacción de unión. Es el único método que proporciona una caracterización termodinámica completa de la unión, incluyendo la constante de asociación en equilibrio (Ka), la energía libre de Gibbs (ΔG), el cambio de entalpía (ΔH), el cambio de entropía (ΔS) y la estequiometría de unión (n) a partir de un solo experimento.
En un experimento de ITC, se inyecta una solución de ligando en pequeñas alícuotas en una celda de muestra que contiene la macromolécula a temperatura constante. Cada inyección produce un pulso de calor a medida que las moléculas de ligando se unen al objetivo. A medida que los sitios de unión se saturan, la señal de calor disminuye hasta que solo permanece el calor de dilución. La celda de referencia contiene solo tampón, y el instrumento mide la potencia diferencial requerida para mantener temperaturas idénticas entre las dos celdas.
El termograma resultante representa el calor por inyección versus el tiempo. La integración de cada pico produce el calor acumulado liberado o absorbido en función de la relación molar de ligando a macromolécula. La regresión no lineal de la isoterma de unión utilizando un modelo de unión adecuado produce Ka, ΔH y n. El ΔG se calcula a partir de Ka, y ΔS se deriva de ΔG = ΔH - TΔS.
ITC puede medir constantes de asociación desde 103 hasta 109 M−1. El límite de detección depende de la magnitud de la entalpía de unión y de la concentración de los reactivos. Los experimentos típicos requieren concentraciones de 10-100 µM de macromolécula en la celda y concentraciones de ligando 10-100 veces mayores en la jeringa.
Las consideraciones de diseño experimental incluyen optimizar el valor c (producto de la concentración del receptor y Ka), seleccionar volúmenes de inyección y determinar el calor de dilución inyectando ligando solo en tampón. La composición del tampón, el pH y la temperatura deben coincidir entre la muestra y la referencia.
Las aplicaciones incluyen la caracterización de interacciones enzima-inhibidor, unión proteína-proteína, interacciones proteína-ADN y reconocimiento anticuerpo-antígeno. ITC también mide cinética enzimática, interacciones de proteínas de membrana y formación de la corona de proteínas alrededor de nanopartículas.
