Los métodos de amplificación isotérmica amplifican ácidos nucleicos a una temperatura constante, eliminando la necesidad de un termociclador. Se utilizan cada vez más en diagnósticos en el punto de atención, pruebas de campo y entornos con recursos limitados.

Descripción General de LAMP

La amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) utiliza 4–6 cebadores que reconocen 6–8 regiones distintas en la secuencia diana. La reacción se realiza a 60–65 °C usando una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena (polimerasa Bst de Bacillus stearothermophilus). La polimerasa desplaza continuamente las cadenas recién sintetizadas, creando estructuras de bucle que sirven como moldes para una mayor amplificación.

El resultado es una amplificación exponencial que produce hasta 10⁹ copias en menos de una hora. Debido al conjunto complejo de cebadores y los productos de amplificación ramificados, LAMP es extremadamente específica — puede discriminar diferencias de un solo nucleótido.

Diseño de Cebadores para LAMP

Un conjunto de cebadores LAMP incluye:

• FIP (cebador interno directo): contiene secuencias F2 y F1c
• BIP (cebador interno reverso): contiene secuencias B2 y B1c
• F3 y B3 (cebadores externos): inician el desplazamiento de cadena
• Cebadores de bucle opcionales (LF y LB): aceleran la reacción al cebar las estructuras de bucle

El diseño de cebadores es crítico y típicamente se realiza con software dedicado (PrimerExplorer, LAMP Designer). La región diana debe ser de 200–300 pb.

Métodos de Detección

Los productos de LAMP pueden detectarse mediante:

• Turbidez: la gran cantidad de precipitado de pirofosfato de magnesio formado durante la amplificación es visible a simple vista.
• Colorantes colorimétricos: el rojo de fenol o el azul de hidroxinaftol cambian de color cuando el pH de la reacción cambia o se consume magnesio.
• Fluorescencia: los colorantes intercalantes (SYBR Green, EvaGreen) o calcéína producen una señal fluorescente.
• Flujo lateral: usando cebadores marcados que incorporan haptenos para detección en tiras inmunocromatográficas.

Otros Métodos Isotérmicos

• RPA (Recombinase Polymerase Amplification): usa una recombinasa para aparear cebadores con ADN dúplex homólogo, una proteína de unión a ADN de cadena sencilla para estabilizar la cadena desplazada, y una polimerasa con desplazamiento de cadena. Opera a 37–42 °C y produce producto detectable en 5–20 minutos. RPA es el método isotérmico más rápido y es compatible con formatos liofilizados.
• HDA (Helicase-Dependent Amplification): usa una helicasa de ADN para desenrollar la doble hélice en lugar de desnaturalización por calor, operando a 37–65 °C dependiendo de la helicasa.
• NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification): amplifica dianas de ARN a 41 °C usando tres enzimas (transcriptasa inversa, RNasa H y ARN polimerasa T7), produciendo amplicones de ARN.

Aplicaciones

La amplificación isotérmica se utiliza ampliamente para la detección de patógenos (SARS-CoV-2, malaria, tuberculosis, virus Zika), pruebas de seguridad alimentaria y monitoreo ambiental. La capacidad de realizar reacciones en un baño de agua o bloque de calor y detectar resultados mediante cambio de color la hace ideal para pruebas descentralizadas.