La cromatografía electrocinética micelar (MEKC) es una modalidad de la electroforesis capilar (CE) introducida por Shigeru Terabe en 1984 que extiende las capacidades de separación de la CE a analitos neutros. En MEKC, las moléculas de tensioactivo añadidas al tampón de corrida en concentraciones superiores a la concentración micelar crítica (CMC) se autoensamblan en micelas que funcionan como una fase pseudostacionaria. La separación de analitos resulta de la partición diferencial de los solutos entre el tampón acuoso (fase móvil) y el interior hidrofóbico de las micelas (fase pseudostacionaria), combinada con la migración diferencial de las micelas cargadas bajo el campo eléctrico aplicado. La MEKC tiende un puente entre la electroforesis clásica, que requiere analitos cargados, y la cromatografía, que se basa en la partición diferencial entre fases.
El principio de solubilización y partición micelar
Los tensioactivos son moléculas anfifílicas que contienen tanto un grupo cabeza hidrofílico como una cola hidrofóbica. En solución acuosa a concentraciones superiores a la CMC, los monómeros de tensioactivo se agregan para formar micelas con las colas hidrofóbicas orientadas hacia el interior y las cabezas hidrofílicas hacia el tampón acuoso. Para el dodecilsulfato de sodio (SDS), el tensioactivo más común en MEKC, la CMC es de aproximadamente 8 mM en agua, y cada micela contiene entre 60 y 70 monómeros. Los analitos neutros se reparten entre la fase acuosa y la pseudofase micelar según su hidrofobicidad: los solutos hidrofóbicos son retenidos más fuertemente por las micelas y migran a la misma velocidad que estas, mientras que los solutos hidrofílicos pasan más tiempo en la fase acuosa y migran con el flujo electroosmótico global. Los analitos cargados experimentan un componente adicional de movilidad electroforética que influye en su comportamiento migratorio general.
La fase pseudostacionaria
La fase pseudostacionaria en MEKC no está fijada físicamente, sino que se mueve con una velocidad determinada por la movilidad electroforética de las micelas y el flujo electroosmótico (EOF). Los tensioactivos aniónicos como el SDS migran hacia el ánodo, pero en condiciones típicas de CE el EOF hacia el cátodo es más fuerte, lo que hace que las micelas migren en la misma dirección que el flujo global, pero a una velocidad reducida. Esto crea una ventana de migración entre el analito más rápido (que no interactúa con las micelas y migra con el EOF) y el analito más lento (que es completamente retenido por las micelas). Todos los analitos neutros eluyen dentro de esta ventana, conocida como rango de elución. La anchura del rango de elución está determinada por la relación del tiempo de migración de las micelas respecto al EOF y es un parámetro crítico que afecta la resolución. Se pueden utilizar otros tensioactivos distintos del SDS, incluidos tensioactivos catiónicos como el bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), tensioactivos no iónicos como Brij-35 y sales biliares como el colato de sodio, para alterar la selectividad en aplicaciones específicas.
Resolución y eficiencia en MEKC
La resolución en MEKC está gobernada por tres factores: eficiencia de separación (número de platos), selectividad (la diferencia relativa en los factores de retención entre dos analitos) y la anchura del rango de elución. El número de platos en MEKC es similar al de CZE, típicamente entre 100.000 y 300.000 platos por metro, debido a que el perfil de flujo tipo tapón del EOF minimiza el ensanchamiento de banda. La selectividad se manipula cambiando el tipo y la concentración del tensioactivo, añadiendo modificadores orgánicos como metanol o acetonitrilo al tampón, o incorporando ciclodextrinas, urea o reactivos de formación de pares iónicos al medio de separación. El rango de elución se expande cuando la velocidad de migración micelar difiere significativamente de la velocidad del EOF, lo que puede lograrse ajustando el pH del tampón, la fuerza iónica o la química de la pared capilar. La optimización de la resolución en MEKC implica equilibrar estos parámetros para lograr una separación adecuada de todos los analitos objetivo en un tiempo de análisis razonable.
Parámetros operativos y desarrollo de métodos
La elección del tipo y concentración de tensioactivo es la variable principal en el desarrollo de métodos MEKC. El SDS a concentraciones de 20 a 100 mM es el punto de partida predeterminado debido a su bajo costo, baja absorbancia UV y comportamiento bien caracterizado. El pH del tampón controla tanto el EOF como el estado de ionización de analitos ácidos o básicos, siendo el rango de pH 7 a 9 el más común para separaciones basadas en SDS. Se añaden disolventes orgánicos como metanol, acetonitrilo y 2-propanol al 5-30 % para reducir la retención de analitos altamente hidrofóbicos y alterar la selectividad. El control de temperatura es esencial porque la CMC, el tamaño micelar y la viscosidad del tampón varían con la temperatura. El voltaje se ajusta típicamente entre 15 y 30 kV, proporcionando voltajes más altos separaciones más rápidas pero mayor calentamiento por Joule. La inyección de muestra se realiza hidrodinámicamente para evitar el sesgo introducido por la inyección electrocinética en presencia de micelas.
Aplicaciones de la MEKC
La MEKC se aplica ampliamente en el análisis farmacéutico para la determinación de pureza, uniformidad de contenido y estabilidad de fármacos, particularmente para fármacos neutros o débilmente ionizados que son difíciles de separar por CZE. En la industria de alimentos y bebidas, la MEKC se utiliza para analizar conservantes, antioxidantes, edulcorantes y cafeína en matrices complejas. Las aplicaciones ambientales incluyen la determinación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), plaguicidas y fenoles en muestras de agua y suelo. En el análisis clínico y biomédico, la MEKC se ha empleado para la cuantificación de esteroides, ácidos biliares, porfirinas y vitaminas en fluidos biológicos. La técnica también se utiliza en el análisis de productos naturales, incluidos flavonoides, alcaloides y cumarinas en extractos vegetales. La combinación de MEKC con detección por espectrometría de masas (MEKC-MS) mediante ionización por electrospray extiende su aplicabilidad a la identificación y caracterización estructural de compuestos desconocidos, requiriendo el uso de tensioactivos volátiles y tampones compatibles con MS.
