La clonación tradicional con enzimas de restricción ha sido complementada — y en muchos laboratorios reemplazada — por métodos de ensamblaje recombinatorio y modular que son más rápidos, sin cicatrices y compatibles con flujos de trabajo de alto rendimiento.

Clonación Gateway

La clonación Gateway utiliza el sistema de recombinación sitio-específica del bacteriófago lambda. Dos reacciones de recombinación secuenciales mueven una secuencia de ADN de interés entre vectores sin enzimas de restricción ni ligasa.

En la reacción BP, un producto de PCR flanqueado por sitios attB se recombina con un vector donante que contiene sitios attP, creando un clon de entrada. La reacción LR luego transfiere el inserto del clon de entrada a cualquier vector de destino que contenga sitios attR. El vector de destino proporciona los elementos de expresión apropiados para el organismo diana.

La clonación Gateway es direccional, no cambia el marco de lectura y permite que el mismo clon de entrada sea transportado a múltiples vectores de destino (ej., para expresión en bacterias, células de mamífero o plantas). Su principal limitación es el tamaño de los sitios de recombinación (aproximadamente 50 pb cada uno), que añaden secuencia adicional al constructo final.

Gibson Assembly

Gibson Assembly une múltiples fragmentos de ADN en una sola reacción isotérmica (50 °C, 15–60 minutos). Requiere tres actividades enzimáticas:

• Una exonucleasa 5′ retrocede los extremos 5′, dejando extremos 3′ monocatenarios solapantes.
• Una ADN polimerasa rellena los huecos.
• Una ADN ligasa sella las mellas.

Los fragmentos deben tener 15–40 pb de secuencia solapante en sus extremos, que típicamente se añade mediante cebadores de PCR. Gibson Assembly puede unir hasta 10–15 fragmentos simultáneamente y es ideal para ensamblar constructos grandes como genes sintéticos, plásmidos completos o casetes de ingeniería genómica. El ensamblaje no deja cicatrices — no quedan sitios de restricción.

Clonación Golden Gate

La clonación Golden Gate utiliza enzimas de restricción Tipo IIS, que cortan fuera de su secuencia de reconocimiento, produciendo extremos cohesivos definidos de 4 pb. Estos extremos pueden ser especificados por el usuario y están diseñados para ser únicos y compatibles.

La reacción es una digestión-ligación en un solo paso: la enzima Tipo IIS y la ADN ligasa T4 se añaden juntas, y la reacción se cicla entre la temperatura óptima de la enzima y 37 °C. Debido a que los sitios de reconocimiento se eliminan después del corte, el producto final ensamblado ya no es digerible, impulsando la reacción hasta su finalización.

Golden Gate es la base de sistemas de clonación modular como MoClo y Plant Toolbox. Es ideal para el ensamblaje combinatorio de partes genéticas (promotores, secuencias codificantes, terminadores) y para construir matrices TALEN o librerías de sgRNA.