PAGE Nativo

A diferencia del SDS-PAGE, el PAGE nativo (no desnaturalizante) separa las proteínas en su conformación nativa sin SDS ni agentes reductores. La tasa de migración depende tanto del tamaño de la proteína como de su carga intrínseca, haciendo que la estimación del peso molecular sea menos directa que en SDS-PAGE — pero preservando la actividad enzimática y las interacciones proteína-proteína.

Tampones: El sistema más común es el sistema de tampón Laemmli sin SDS. El gel separador está a pH 8.8 y el gel concentrador a pH 6.8, ambos con tampón de corrida Tris-glicina. Las proteínas llevan una carga neta negativa al pH de corrida y migran hacia el ánodo.

PAGE Nativo Azul (BN-PAGE): se añade Azul de Coomassie G-250 al tampón del cátodo y a la muestra de proteína. El colorante se une a superficies hidrofóbicas, impartiendo una carga negativa uniforme sin desnaturalizar las proteínas. Esto permite la separación de complejos de proteínas de membrana (ej., supercomplejos de la cadena respiratoria) que son insolubles en condiciones nativas estándar.

Aplicaciones:

• Determinar el estado oligomérico de proteínas (monómero, dímero, tetrámero).
• Analizar complejos multiproteicos mediante Western blot o espectrometría de masas después de digestión en gel (PAGE nativo seguido de SDS-PAGE 2D).
• Detectar isoformas enzimáticas con diferentes movilidades electroforéticas.
• Control de calidad para purificación de proteínas (evaluación de agregación).

Limitaciones: la resolución es generalmente menor que la del SDS-PAGE. Las proteínas ácidas y básicas co-migran pobremente en el mismo sistema de gel. La calibración con marcadores de peso molecular nativos da solo tamaños aproximados.

Zimografía

La zimografía detecta actividad enzimática directamente en un gel de poliacrilamida mediante la co-polimerización de un sustrato en el gel separador. Después de la electroforesis, el gel se incuba en un tampón de renaturalización para restaurar la actividad enzimática, luego se tiñe. La actividad enzimática aparece como una banda clara sobre un fondo oscuro donde el sustrato ha sido degradado.

Tipos de zimografía:

• Zimografía con gelatina: se incorpora gelatina (colágeno desnaturalizado) al 0.1%. Se usa para metaloproteinasas de matriz (MMP). Después de la incubación, el gel se tiñe con Azul de Coomassie — la actividad de MMP aparece como bandas blancas/transparentes sobre un fondo azul.
• Zimografía con caseína: la caseína es el sustrato. Se usa para serina proteasas y activadores del plasminógeno.
• Zimografía inversa: el gel contiene tanto el sustrato como un inhibidor. La actividad del inhibidor aparece como bandas oscuras donde el sustrato se ha preservado de la degradación.
• Ensayos de quinasa en gel: el gel se polimeriza con un sustrato de proteína quinasa, y después de la electroforesis, renaturalización e incubación con [γ-³²P]ATP, las bandas fosforiladas se detectan por autorradiografía.

Resumen del protocolo para zimografía con gelatina:

1. Prepare el gel separador con gelatina al 0.1% (y SDS).
2. Cargue muestras en condiciones no reductoras (sin hervir, sin agentes reductores — estos desnaturalizan las MMP).
3. Corra a 4 °C para prevenir proteólisis prematura.
4. Elimine el SDS lavando el gel en Triton X-100 al 2.5% durante 30 minutos (2 veces).
5. Incube en tampón de desarrollo (Tris 50 mM, CaCl₂ 10 mM, NaCl 0.15 M, pH 7.5) a 37 °C durante 16–48 horas.
6. Tiña con Azul de Coomassie y decolore.

La zimografía es altamente sensible (detecta cantidades de picogramos de enzima activa) y puede distinguir entre formas pro-enzima (latentes) y activas según el peso molecular.