La fosforilación oxidativa es la etapa final de la respiración celular y ocurre en la membrana mitocondrial interna. Utiliza la energía liberada por la cadena de transporte de electrones para impulsar la síntesis de ATP, produciendo la gran mayoría de la energía celular.
Cómo funciona la fosforilación oxidativa
La cadena de transporte de electrones
El NADH y el FADH2 de la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico donan electrones a complejos proteicos incrustados en la membrana mitocondrial interna. Estos complejos (Complejos I a IV) hacen pasar electrones a través de una serie de reacciones redox, cada una con un potencial de reducción progresivamente mayor.
Bombeo de protones
A medida que los electrones se mueven a través de la cadena, la energía liberada se utiliza para bombear protones (H+) desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Los complejos I, III y IV contribuyen cada uno a construir este gradiente de protones. El resultado es una alta concentración de protones en el espacio intermembrana y una baja concentración en la matriz.
La fuerza motriz del protón
El gradiente electroquímico creado por la diferencia de concentración de protones y el potencial de membrana se denomina fuerza motriz de protones. Esta fuerza almacena energía potencial, de forma muy parecida al agua detrás de una presa.
Síntesis de ATP
Los protones regresan a la matriz a través de la ATP sintasa (Complejo V), una turbina molecular. A medida que los protones pasan a través de la enzima, ésta gira, impulsando la fosforilación de ADP a ATP. Por cada diez protones que fluyen se producen aproximadamente de tres a cuatro moléculas de ATP.
Oxígeno como aceptor terminal de electrones
El oxígeno es el aceptor final de electrones en el Complejo IV. Acepta electrones y se combina con protones para formar agua. Sin oxígeno, la cadena de transporte de electrones retrocede y se detiene la fosforilación oxidativa.
Rendimiento de ATP
La oxidación completa de una molécula de glucosa produce aproximadamente 30 a 32 moléculas de ATP a través de la fosforilación oxidativa, superando con creces las 2 ATP producidas solo por la glucólisis.
Medición práctica de la tasa de consumo de oxígeno
Mida la tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando un analizador Seahorse XF o un electrodo de oxígeno tipo Clark. Para los ensayos de Seahorse, siembre las células a 1–4 × 10⁴ células/pocillo en una placa XF96, cultive durante la noche y luego reemplace el medio con XF DMEM que contenga glucosa 10 mM y glutamina 2 mM. Equilibrar a 37°C durante 1 hora. Mida el OCR basal durante tres ciclos (3 minutos de mezcla, 2 minutos de espera, 3 minutos de medición). Inyecte oligomicina de 1 m (inhibidor del complejo V) a través del puerto A: la caída de OCR revela la fracción acoplada a la síntesis de ATP (respiración ligada a ATP). Inyecte FCCP (desacoplador) de 0,5 µM a través del puerto B: el OCR alcanza su máximo (capacidad respiratoria máxima) y la capacidad respiratoria adicional se calcula como (OCR máximo - OCR basal). Inyecte rotenona 0,5 m (inhibidor del complejo I) más antimicina A 1 m (inhibidor del complejo III) a través del puerto C: el OCR cae a niveles no mitocondriales, lo que confirma que la señal medida se origina en la respiración mitocondrial. Para mitocondrias aisladas, utilice un electrodo Clark: agregue 0,5 mg de mitocondrias a 1 ml de tampón de respiración (manitol 225 mM, sacarosa 75 mM, KCl 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, KH2PO4 5 mM, BSA al 0,1%) con succinato 5 mM o piruvato 5 mM más malato 2 mM. como sustratos. La respiración del estado 3 (estimulada por ADP) se inicia añadiendo ADP 0,5 mM; El estado 4 (reposo) se mide después del agotamiento del ADP.
Aplicación del mundo real
En un estudio de disfunción mitocondrial en la enfermedad de Parkinson, los fibroblastos de pacientes con mutaciones PINK1 muestran una OCR basal reducida (40 pmol/min frente a 80 pmol/min en los controles) y una capacidad respiratoria mínima. La inyección de rotenona confirma que la actividad del Complejo I está específicamente alterada. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la disfunción mitocondrial contribuye a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson.
