La presentación en fagos (phage display) es una técnica poderosa de biología molecular que fusiona genéticamente péptidos o proteínas extraños con proteínas de la cápside de bacteriófagos, mostrándolos en la superficie del fago mientras el ADN codificante permanece empaquetado en el interior. Este vínculo directo genotipo-fenotipo permite el cribado de bibliotecas grandes (>10^9 variantes) para la unión a un objetivo de interés, amplificando los fagos unidos mediante infección bacteriana para rondas de selección posteriores.

La técnica se utiliza ampliamente para el descubrimiento de anticuerpos, la ingeniería de proteínas, el mapeo de epítopos y el desarrollo de fármacos, y fue reconocida con el Premio Nobel de Química 2018 otorgado a George P. Smith y Sir Gregory P. Winter por su desarrollo y aplicación.

Principio

Los fagos filamentosos como M13 son la plataforma más común. El genoma del fago se modifica para fusionar una secuencia de ADN extraño que codifica un péptido o dominio proteico con uno de los genes de la proteína de la cápside, más frecuentemente el gen III (pIII, 3–5 copias en el extremo) o el gen VIII (pVIII, ~2700 copias a lo largo del filamento). Cuando el genoma del fago recombinante se introduce en E. coli, la proteína de fusión se expresa y se incorpora al virión ensamblado, mostrando el péptido extraño en la superficie. El ADN que codifica la proteína mostrada permanece físicamente vinculado dentro de la misma partícula de fago, creando un enlace directo entre fenotipo (proteína mostrada) y genotipo (ADN encapsidado). Este enlace es la característica clave — permite a los investigadores recuperar el material genético que codifica un ligante seleccionado simplemente infectando bacterias con el fago eluido.

Componentes Clave

Vectores de presentación vienen en dos formatos. Los vectores de fago llevan el genoma completo del fago con la fusión insertada directamente, produciendo fagos recombinantes que muestran la fusión en cada copia de la proteína de la cápside. Los vectores de fagémido son plásmidos que contienen el gen de fusión más una señal de empaquetamiento del fago, requiriendo coinfección con un fago auxiliar para suministrar las proteínas estructurales restantes y la maquinaria de replicación — esto produce una mezcla de proteínas de cápside de tipo salvaje y de fusión, y es el sistema más común para bibliotecas de anticuerpos.

Fusiones de proteínas de la cápside determinan la valencia y la aplicación de la presentación. Las fusiones pIII muestran 1–5 copias por virión y se prefieren para selecciones basadas en afinidad (baja valencia minimiza los efectos de avidez). Las fusiones pVIII muestran cientos de copias, adecuadas para presentaciones inmunogénicas o cuando se desea alta avidez. Los sistemas alternativos usan pVI, pVII o pIX para aplicaciones especializadas.

Fagos auxiliares (e.g., M13KO7, Hyperphage) proporcionan las proteínas de la cápside de tipo salvaje y las funciones de replicación necesarias para el empaquetamiento de fagémidos. Llevan un origen de replicación defectuoso y marcadores de selección antibiótica.

Ciclo de Biopanning

La selección se realiza mediante rondas repetidas de biopanning:

1. Unión — La biblioteca de fagos se incuba con el objetivo inmovilizado (proteína recubierta en placas ELISA, objetivo biotinilado en perlas de estreptavidina, células enteras o secciones de tejido). La unión inespecífica se reduce mediante prebloqueo con BSA o leche y la inclusión de detergentes como Tween-20.
2. Lavado — Los fagos no unidos y débilmente unidos se eliminan mediante lavados repetidos con condiciones de creciente rigurosidad (aumento de sal, detergente o tiempo de incubación).
3. Elución — Los fagos unidos se recuperan del objetivo, típicamente mediante elución a pH bajo (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,2), digestión enzimática (tripsina para fusiones sensibles a proteasas) o elución competitiva con exceso de objetivo libre.
4. Amplificación — El pool de fagos eluidos se utiliza para infectar E. coli (típicamente TG1 o ER2738), produciendo progenie de fagos amplificada para la siguiente ronda. La amplificación se realiza en cultivo líquido con rescate de fago auxiliar.
5. Enriquecimiento — Después de 3–5 rondas, el pool se enriquece en ligantes de alta afinidad. El enriquecimiento se monitorea comparando los títulos de salida entre pocillos recubiertos con objetivo y pocillos de control, o mediante ELISA de fagos policlonal.

Bibliotecas de Presentación en Fagos

Bibliotecas de péptidos muestran secuencias peptídicas aleatorias (típicamente 7–15 aminoácidos) fusionadas a pIII o pVIII. Se utilizan para mapeo de epítopos, descubrimiento de mimotopos e identificación de ligandos para receptores o enzimas.

Bibliotecas de anticuerpos muestran fragmentos variables de cadena única (scFv) o fragmentos de unión a antígeno (Fab) en la superficie del fago. Las bibliotecas vírgenes se construyen a partir de repertorios de genes V reordenados de donantes inmunizados o no inmunizados. Las bibliotecas sintéticas se construyen a partir de andamios de genes V modificados con regiones determinantes de complementariedad (CDR) aleatorizadas. Las bibliotecas inmunes se derivan de células B de animales inmunizados y están enriquecidas en clones específicos de antígeno. La presentación en fagos es uno de los métodos principales para generar anticuerpos completamente humanos para uso terapéutico, junto con ratones transgénicos y clonación de células B individuales.

Bibliotecas de ingeniería de proteínas muestran variantes mutadas de una proteína de interés, permitiendo la evolución dirigida para mejorar la afinidad de unión, la termoestabilidad, la actividad enzimática o el rendimiento de expresión.

Aplicaciones

Descubrimiento de anticuerpos es la aplicación comercialmente más significativa, con docenas de anticuerpos completamente humanos descubiertos mediante presentación en fagos que han llegado a la clínica (e.g., adalimumab, belimumab, raxibacumab). La presentación en fagos permite la generación de anticuerpos contra objetivos que son tóxicos, no inmunogénicos o altamente conservados entre especies.

Mapeo de epítopos utiliza bibliotecas de péptidos en presentación en fagos para identificar epítopos lineales y conformacionales reconocidos por anticuerpos monoclonales o sueros de pacientes. El biopanning contra un anticuerpo objetivo selecciona péptidos que imitan el epítopo natural, identificados mediante secuenciación de ADN de los clones enriquecidos.

Evolución de proteínas mediante mutagénesis y selección con presentación en fagos puede mejorar la afinidad de unión (maduración de afinidad), alterar la especificidad, aumentar la estabilidad o desarrollar nuevas actividades enzimáticas. La PCR propensa a errores, el barajado de ADN y la mutagénesis dirigida generan bibliotecas de variantes para la selección.

Terapéuticos y diagnósticos dirigidos incluyen péptidos mostrados en fagos para la administración dirigida de fármacos, sondas de imagen y moléculas de unión biespecíficas. La presentación en fagos también se ha utilizado para seleccionar péptidos que se dirigen a tejidos específicos o a la vasculatura tumoral in vivo.

Ventajas y Limitaciones

Las ventajas incluyen el vínculo directo genotipo-fenotipo (simplificando la identificación de clones), la capacidad de cribar bibliotecas muy grandes (10^9–10^11 variantes), la naturaleza in vitro de la selección (evitando la inmunización) y el sistema de producción bacteriano robusto y de bajo costo.

Las limitaciones incluyen el tamaño restringido de las proteínas mostradas (las proteínas grandes con múltiples dominios pueden no plegarse o mostrarse eficientemente), el contexto de expresión procariota (carente de modificaciones postraduccionales eucariotas como la glicosilación) y los posibles sesgos en la representación de la biblioteca debido a diferencias en la eficiencia de presentación o toxicidad bacteriana.

Variantes

Tecnologías de presentación alternativas abordan algunas de estas limitaciones. La presentación en ribosomas y la presentación en ARNm funcionan completamente in vitro sin células vivas, permitiendo bibliotecas aún más grandes (10^12–10^14) y la presentación de proteínas tóxicas o inestables. La presentación en levadura proporciona un sistema de expresión eucariota con mecanismos de control de calidad y permite la discriminación cuantitativa mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Cada plataforma tiene fortalezas complementarias, y la presentación en fagos sigue siendo la más utilizada debido a su robustez, simplicidad y trayectoria en el descubrimiento de fármacos.