Descripción general
La fosfoproteómica es el estudio a gran escala de la fosforilación de proteínas, una de las modificaciones postraduccionales más generalizadas y funcionalmente importantes. La fosforilación regula casi todos los aspectos de la vida celular, incluida la actividad enzimática, las interacciones proteína-proteína, la localización subcelular y la transducción de señales. La fosfoproteómica tiene como objetivo identificar qué proteínas están fosforiladas, en qué residuos (principalmente serina, treonina y tirosina) y cómo cambia el estado de fosforilación en respuesta a los estímulos. El campo combina estrategias de enriquecimiento de fosfopéptidos con espectrometría de masas de alta resolución y bioinformática especializada para mapear el fosfoproteoma a una profundidad sin precedentes.
Conceptos clave
El enriquecimiento con fosfopéptidos es esencial porque los péptidos fosforilados suelen ser subestequiométricos en relación con sus homólogos no fosforilados. Los métodos de enriquecimiento comunes incluyen la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y la cromatografía con dióxido de titanio (TiO2), las cuales explotan la afinidad de los grupos fosfato por los óxidos metálicos. Los algoritmos de localización del sitio como Ascore, Mascot Delta Score y la probabilidad de localización de MaxQuant determinan el residuo exacto que transporta el fosfato. Análisis de motivos identifica patrones de secuencia alrededor de los sitios de fosforilación para inferir preferencias de quinasa aguas arriba. Las relaciones quinasa-sustrato pueden predecirse a partir de estos motivos y validarse experimentalmente.
Protocolo práctico
Un flujo de trabajo de fosfoproteómica estándar comienza con la extracción y digestión de proteínas. Las células o los tejidos se lisan en un tampón desnaturalizante que contiene inhibidores de la fosfatasa (p. ej., ortovanadato de sodio, beta-glicerofosfato) para preservar el estado de fosforilación. Las proteínas se digieren con tripsina durante la noche y la mezcla de péptidos resultante se desala utilizando cartuchos C18. A continuación se realiza el paso crítico de enriquecimiento: la mezcla de péptidos se carga en una columna de TiO2 o IMAC, donde los fosfopéptidos se unen a través de sus grupos fosfato al óxido metálico o a los iones metálicos inmovilizados. Los péptidos no fosforilados se eliminan por lavado con tampones que contienen 80 % de acetonitrilo y 0,5 % de ácido trifluoroacético, mientras que los fosfopéptidos se eluyen utilizando un tampón de fosfato alcalino o una solución de amoníaco al 5 %. La fracción enriquecida se analiza mediante LC-MS/MS o CE-MS utilizando electroforesis de zona capilar en un espectrómetro de masas Orbitrap de alta resolución. Los datos sin procesar se procesan utilizando MaxQuant con la fosforilación de serina, treonina y tirosina configuradas como modificaciones variables. Las puntuaciones de probabilidad de localización del sitio de MaxQuant determinan el residuo fosforilado exacto. El análisis posterior incluye el enriquecimiento de motivos utilizando herramientas como IceLogo para identificar secuencias de consenso de quinasa y la inferencia de la red de sustrato de quinasa mediante el análisis de enriquecimiento de sustrato de quinasa (KSEA). En una aplicación del mundo real, este flujo de trabajo mapeó más de 20.000 fosfositos en células HeLa estimuladas por EGF, revelando la fosforilación dinámica de la red de señalización de EGFR a los pocos minutos de la estimulación. Otro ejemplo es el mapeo sistemático del fosfoproteoma de respuesta al daño del ADN, donde 5.000 fosfositos regulados identificaron sustratos de quinasa ATM y ATR críticos para la activación de los puntos de control del ciclo celular y la reparación del ADN.
Aplicaciones
La fosfoproteómica es fundamental para comprender las redes de señalización celular. Ha mapeado las cascadas de señalización aguas abajo de receptores tirosina quinasas y receptores acoplados a proteína G, reveló interferencias con las vías del segundo mensajero y dilucidó las vías JAK-STAT señalización eje. En la investigación del cáncer, la fosfoproteómica identifica quinasas aberrantemente activas que pueden servir como objetivos terapéuticos, lo que permite enfoques oncológicos de precisión que relacionan los inhibidores con los nodos de señalización desregulados que impulsan el crecimiento tumoral.
