La proteína A y la proteína G son proteínas bacterianas de unión a inmunoglobulinas que se unen a la región Fc de los anticuerpos, permitiendo la purificación rápida en un solo paso de anticuerpos policlonales y monoclonales a partir de suero, líquido de ascitis o sobrenadantes de cultivo celular.
Principio
La proteína A (de Staphylococcus aureus) y la proteína G (de Streptococcus sp.) se unen específicamente a la región Fc de los anticuerpos IgG sin reconocer la región Fab de unión al antígeno. Esto preserva la funcionalidad del anticuerpo después de la purificación. Las proteínas bacterianas se inmovilizan en agarosa o perlas magnéticas y se utilizan como reactivos de captura por afinidad. Los anticuerpos se unen a pH fisiológico y se eluyen a pH bajo (2.5–3.0), que interrumpe la interacción Fc-Proteína A/G. Las fracciones eluidas se neutralizan inmediatamente para prevenir la desnaturalización ácida.
Proteína A vs. Proteína G
La proteína A se une a las subclases de IgG humana con afinidad variable: fuerte a IgG1, IgG2 e IgG4 pero débil a IgG3. También se une bien a IgG de conejo, cerdo, perro y cobaya, pero se une débilmente a IgG de cabra, oveja, rata y ratón IgG1. La proteína G se une a un rango más amplio de subclases de IgG entre especies, incluyendo todas las subclases de IgG humana, IgG1 de ratón, cabra, oveja y rata. La proteína A/G es una proteína de fusión recombinante que combina los dominios de unión de ambas, proporcionando la cobertura más amplia de especies y subclases. La elección depende de la especie y el isotipo del anticuerpo. Para la mayoría de los sueros policlonales, la agarosa proteína A/G ofrece el mejor rendimiento.
Formatos de Resina
La proteína A, la proteína G y la proteína A/G están disponibles acopladas a agarosa, Sepharose y perlas magnéticas. Proteína A Sepharose (Cytiva) y MabSelect SuRe (un derivado de proteína A estabilizado con álcali) son estándares para la purificación de anticuerpos monoclonales. Las variantes recombinantes de proteína A con estabilidad alcalina mejorada permiten la limpieza con NaOH 0.1–0.5 M para eliminar endotoxinas. La capacidad de unión varía de 5–20 mg de IgG humana por mL de resina, dependiendo de la resina y las condiciones de flujo. Las resinas de alta capacidad (30–50 mg/mL) se utilizan para bioprocesamiento.
Sistema de Tampones
Tampón de carga: fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4 (PBS) o Tris-HCl 20 mM, pH 7.5–8.0. Tampón de lavado: el mismo que el de carga, a veces con Tween-20 al 0.1% o NaCl 1 M para lavado riguroso. Tampón de elución: glicina-HCl 0.1 M, pH 2.5–3.0, o citrato 0.1 M, pH 3.0. Tampón de neutralización: Tris-HCl 1 M, pH 8.5–9.0 (añadir 50–100 µL por mL de eluato). Para elución suave, se pueden usar MgCl₂ 2–3 M o KSCN 3.5 M, aunque estos caótropos pueden afectar algunos anticuerpos.
Protocolo
Equilibrar la resina de proteína A/G con tampón de carga. Cargar el suero clarificado (diluido 1:1 en tampón de carga) o sobrenadante de cultivo (concentrado 10 veces si el título es bajo) a 0.5–1 mL/min o rotar en batch durante 30 min a 4 °C. Lavar con 10–15 volúmenes de columna de tampón de carga hasta que A₂₈₀ alcance la línea base. Eluir con 5–10 volúmenes de columna de tampón de elución, recogiendo fracciones de 0.5–1 mL en tubos que contienen tampón de neutralización. Agrupar las fracciones del pico A₂₈₀ y dializar o intercambiar tampón a PBS o tampón de almacenamiento. La SDS-PAGE en condiciones reductoras muestra bandas de 25 kDa (cadena ligera) y 50 kDa (cadena pesada).
Maduración de Afinidad y Variantes Modificadas
Las variantes recombinantes de proteína A (MabSelect SuRe, ProSep Ultra Plus) están diseñadas para mayor capacidad de unión, mejor estabilidad alcalina (tolerancia a NaOH >0.5 M para limpieza in situ) y menor lixiviación del ligando. Estas resinas son esenciales para la fabricación biofarmacéutica donde se aplican requisitos de reutilización de columnas (>100 ciclos) y pureza estricta.
Aplicaciones
La purificación con proteína A/G es el estándar de oro para la purificación de anticuerpos en investigación e industria. Los anticuerpos monoclonales de sobrenadantes de hibridoma, los anticuerpos policlonales de suero de conejo o cabra y los anticuerpos monoclonales terapéuticos humanos de cultivos de células CHO se purifican rutinariamente mediante este método. La inmunoprecipitación de complejos anticuerpo-antígeno utiliza perlas magnéticas de proteína A/G para capturar el anticuerpo, junto con su antígeno unido. Para formatos de alto rendimiento, la proteína A/G se utiliza en captura por afinidad multiplexada y cribado de anticuerpos en placas de 96 pocillos.
