Descripción general
Las redes de interacción proteína-proteína (PPI) son representaciones gráficas de los contactos físicos entre proteínas dentro de una célula. Cada proteína es un nodo, y cada interacción detectada experimentalmente o predicha computacionalmente es una ventaja. Estas redes revelan la organización funcional del proteoma: las proteínas que interactúan a menudo participan en el mismo proceso biológico, residen en el mismo compartimento celular o forman complejos estables. Al estudiar la topología de la red, los investigadores pueden identificar proteínas centrales altamente conectadas, módulos funcionales y vías que están desreguladas en las enfermedades. Las redes PPI integran datos de múltiples técnicas experimentales y son esenciales para la biología de sistemas.
Conceptos clave
Las fuentes experimentales de datos de PPI incluyen la detección de dos híbridos de levadura, la purificación por afinidad seguida de espectrometría de masas (AP-MS) y la coinmunoprecipitación. Cada método captura diferentes aspectos de las interacciones: binarias versus co-complejas, estables versus transitorias. Propiedades de la red como la distribución de grados, el coeficiente de agrupamiento y la centralidad de intermediación caracterizan la arquitectura global. Las proteínas centrales que conectan a muchos socios suelen ser esenciales para la viabilidad celular. Módulos funcionales son subgrafos densamente conectados que corresponden a complejos de proteínas o vías de señalización. Las enfermedades frecuentemente surgen de mutaciones que alteran bordes o nodos específicos dentro de estas redes, un concepto conocido como medicina de redes.
Protocolo práctico
Un flujo de trabajo práctico de AP-MS comienza con la expresión de una proteína cebo marcada en la línea celular relevante. El cebo suele fusionarse con una etiqueta FLAG, GFP o StrepII mediante transfección estable o transducción lentiviral. Las células que expresan el cebo marcado se lisan en condiciones suaves (normalmente 0,5% de NP-40 o tampón de digitonina) para preservar los complejos proteicos. El lisado se incuba con resina de afinidad, como perlas de agarosa anti-FLAG o StrepTactin Sepharose, durante 2 a 4 horas a 4 °C. Después de un lavado extenso con tampón de lisis para eliminar aglutinantes no específicos, las proteínas unidas se eluyen usando un exceso de péptido FLAG o tampón de elución SDS. El eluato se digiere con tripsina y se analiza mediante LC-MS/MS. Los datos sin procesar se buscan en una base de datos de proteínas y la lista de proteínas resultante se filtra para eliminar contaminantes comunes utilizando el repositorio CRAPome. El filtrado estadístico compara la abundancia de presas en muestras de cebo con los controles utilizando la puntuación SAINT, que integra recuentos espectrales y reproducibilidad entre réplicas biológicas. Se utilizan interactores de alta confianza con una probabilidad SAINT superior a 0,95 para construir una red PPI en Cytoscape. Para los experimentos de BioID, el flujo de trabajo es similar pero utiliza una biotina ligasa promiscua fusionada al cebo, que biotinila las proteínas proximales en las células vivas; Las proteínas biotiniladas se capturan en perlas de estreptavidina, lo que permite la detección de interacciones débiles y transitorias. En una aplicación ejemplar, la AP-MS del proteosoma 26S humano identificó 33 subunidades y 10 chaperonas de ensamblaje, lo que revela la vía de biogénesis de este complejo esencial. BioID se ha utilizado para mapear el interactoma de la envoltura nuclear, identificando más de 300 proteínas y descubriendo nuevos componentes del complejo de poros nucleares.
Aplicaciones
Las redes PPI se utilizan para predecir la función de las proteínas mediante culpa por asociación: una proteína no caracterizada que interactúa con proteínas reparadoras del ADN conocidas probablemente esté involucrada en la reparación del ADN. En el descubrimiento de fármacos, las redes identifican módulos de enfermedades y priorizan objetivos terapéuticos. El campo se basa en métodos experimentales como el sistema de dos híbridos de levadura y las interacciones antígeno-anticuerpo para su validación. El análisis de redes también contextualiza los datos de interacciones proteína-proteína para generar hipótesis mecanicistas sobre la regulación celular.
