La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo natural en el que moléculas de ARN pequeñas silencian la expresión génica al dirigirse al ARNm complementario para su degradación o represión traduccional. Es una de las herramientas más poderosas para la genómica funcional.
Mecanismo
La vía de ARNi comienza con ARN de doble cadena (ARNdc) que es escindido por la enzima Dicer en ARN interferentes pequeños (siRNA) de 21–23 nucleótidos. Estos siRNA se cargan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), donde la cadena guía se retiene y la cadena pasajera se descarta. La cadena guía se aparea con el ARNm complementario, y Argonaute-2 (Ago2), el componente catalítico de RISC, escinde el ARNm, evitando la traducción.
Los microARN endógenos (miRNA) siguen una vía similar pero se originan a partir de precursores en horquilla (pri-miRNA → pre-miRNA → miRNA maduro). La mayoría de los miRNA se unen con complementariedad imperfecta a la 3′ UTR de los ARNm diana, causando represión traduccional en lugar de escisión.
Herramientas Experimentales de ARNi
- siRNA sintético: dúplex de ARNdc de 21 pb con extremos salientes de 2 nt. Transfectado directamente en las células. Efectivo durante 3–7 días. El enfoque más común para el silenciamiento transitorio.
- shRNA (ARN en horquilla corta): expresado desde un plásmido o vector viral. La horquilla es procesada por Dicer en siRNA. El shRNA puede integrarse establemente usando vectores lentivirales, permitiendo el silenciamiento a largo plazo y la creación de líneas celulares estables.
- Mimetizadores e inhibidores de miRNA: ARN sintéticos que imitan miRNA endógenos (mimetizadores) o los bloquean (antagomirs, sondas LNA). Se usan para estudiar la función de miRNA específicos.
Consideraciones de Diseño
El diseño efectivo de siRNA requiere:
- Dirigirse a la región codificante o 3′ UTR del gen
- Evitar coincidencias fuera de diana (verificar con BLAST)
- Contenido GC entre 35–55%
- Evitar repeticiones internas y estructura secundaria
Se recomiendan múltiples siRNA por diana. Incluya un control de siRNA no dirigido (scrambled) para distinguir efectos específicos de no específicos. Un control positivo (ej., siRNA contra un gen de mantenimiento) confirma que la transfección y la maquinaria de ARNi están funcionando.
Limitaciones
- Efectos fuera de diana: los siRNA pueden silenciar genes no deseados mediante complementariedad parcial, particularmente en la región semilla (posiciones 2–8).
- Respuesta de interferón: el ARNdc largo (>30 pb) desencadena una respuesta inmune innata. Use siRNA sintéticos purificados para evitar esto.
- Durabilidad: el siRNA se diluye por división celular. Para experimentos a largo plazo, use shRNA o múltiples transfecciones.
- Silenciamiento incompleto: la proteína residual puede seguir siendo funcional. Confirme el silenciamiento tanto a nivel de ARNm (qPCR) como de proteína (Western blot).
