La cromatografía de fase reversa separa moléculas según su hidrofobicidad, utilizando una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Es el modo más utilizado de cromatografía líquida en química analítica y proteómica.
Principio
La fase estacionaria consiste en cadenas alquilo (C₄, C₈, C₁₈ o grupos fenilo) unidas covalentemente a partículas de sílice o polímero. La fase móvil es una mezcla de agua y un disolvente orgánico miscible con agua como acetonitrilo, metanol o isopropanol. Los compuestos polares interactúan débilmente con la fase estacionaria no polar y eluyen temprano, mientras que los compuestos no polares se reparten en la fase estacionaria y eluyen más tarde a medida que aumenta la concentración de disolvente orgánico. La retención se rige por la hidrofobicidad del analito, descrita por log P, el coeficiente de reparto octanol-agua.
Fases Estacionarias
Las columnas C₁₈ (octadecilo) son las más comunes, proporcionando una fuerte retención para un amplio rango de analitos. Las columnas C₈ (octilo) ofrecen una retención ligeramente menor y una selectividad diferente. Las columnas C₄ se prefieren para proteínas porque la cadena alquilo más corta reduce la desnaturalización. Las columnas fenilo añaden interacciones aromáticas pi-pi. Las partículas de núcleo recubierto (fused-core) combinan un núcleo sólido con una cubierta porosa, reduciendo la longitud de la trayectoria de difusión y mejorando la eficiencia sin presión ultra alta. Las partículas totalmente porosas de menos de 2 µm permiten separaciones UHPLC.
Fases Móviles
La fase acuosa es típicamente agua con ácido fórmico al 0.1% (para EM), TFA al 0.05% (para péptidos) o tampón fosfato (para detección UV). La fase orgánica es acetonitrilo (bajo corte UV, baja viscosidad), metanol (mayor viscosidad, selectividad diferente) o isopropanol (eluyente fuerte, útil para compuestos muy hidrofóbicos). La elución en gradiente aumenta la proporción orgánica del 5% al 95% en 10–60 minutos. La elución isocrática utiliza una composición constante para separaciones simples.
Retención y Selectividad
El factor de retención k’ describe cuán fuertemente se retiene un analito. La selectividad α describe la separación entre dos picos. La resolución Rₛ combina retención, selectividad y eficiencia. La longitud de la columna, el tamaño de partícula, el caudal, la temperatura y la pendiente del gradiente influyen en la resolución. El análisis de Van Deemter de la altura de plato versus la velocidad lineal ayuda a optimizar la eficiencia para una columna dada.
Mapeo de Péptidos Trípticos
La RPC es el método de elección para el mapeo de péptidos en proteómica. Las proteínas se digieren con tripsina, que corta después de los residuos de lisina y arginina. Los péptidos resultantes se separan en una columna C₁₈ con un gradiente de acetonitrilo. Cada proteína produce un mapa peptídico característico. En proteómica bottom-up, la columna RPC se acopla directamente a un espectrómetro de masas con ionización por electrospray. Las columnas RPC de nanoflujo (75 µm de diámetro interno, empaquetadas con C₁₈ de 3 µm) a 200–300 nL/min proporcionan la sensibilidad necesaria para analizar muestras de proteínas de pocos nanogramos. La separación multidimensional combina intercambio catiónico fuerte con RPC en flujos de trabajo MudPIT.
Desalado
La RPC también sirve como paso de desalado o intercambio de tampón. Los péptidos cargados en una columna de captura C₁₈ en condiciones acuosas se retienen mientras que las sales y los contaminantes hidrofílicos pasan. Un gradiente corto eluye la muestra limpia directamente al espectrómetro de masas (configuración trap-elute), mejorando la estabilidad de ionización y la sensibilidad.
Aplicaciones
La RPC se aplica en análisis farmacéuticos (pureza de fármacos, pruebas de estabilidad), química clínica (monitorización de fármacos terapéuticos, perfilado de esteroides), análisis de alimentos (residuos de plaguicidas, aditivos) y análisis ambiental (contaminantes en agua). En biotecnología, la RPC analiza variantes de proteínas recombinantes, productos de desamidación y especies de oxidación críticas para la evaluación de la calidad del producto. El mapeo peptídico mediante RPC es un ensayo de liberación para la identidad y consistencia de lotes biofarmacéuticos.
