Descripción general
La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) mide el transcriptoma de células individuales, proporcionando una resolución sin precedentes de la heterogeneidad celular. Bulk RNA-seq promedia la expresión genética en millones de células, enmascarando los distintos estados transcripcionales de diferentes tipos de células. Por el contrario, scRNA-seq captura el perfil de expresión de cada célula por separado, lo que permite el descubrimiento de poblaciones de células raras, la reconstrucción de trayectorias de desarrollo y la caracterización de respuestas específicas de cada tipo de célula. Desde el primer estudio de scRNA-seq en 2009, la tecnología ha avanzado rápidamente, con plataformas modernas que perfilan decenas de miles de células en un solo experimento.
Métodos
El flujo de trabajo de scRNA-seq implica el aislamiento celular (utilizando plataformas basadas en gotas como 10x Genomics Chromium, microfluidos como Fluidigm C1 o métodos basados en placas), transcripción inversa con identificadores moleculares únicos (UMI) para eliminar el sesgo de amplificación y preparación de la biblioteca para la secuenciación. El análisis bioinformático se realiza mediante: control de calidad (filtrado de células por recuento de genes, contenido mitocondrial y recuentos de UMI), normalización (SCTransform, scran o BASiCS), corrección por lotes (Harmony, Seurat’s CCA o scVI), reducción de dimensionalidad (PCA seguida de visualización UMAP o t-SNE), agrupación (algoritmos de Lovaina o Leiden) y diferencial expresión entre grupos. La anotación del tipo de célula utiliza genes marcadores y bases de datos de referencia.
Aplicaciones
scRNA-seq ha transformado múltiples campos. Ha creado atlas celulares completos para órganos humanos, mapeó el embrión en desarrollo y reveló subtipos de células previamente desconocidas en el cerebro y el sistema inmunológico. En la investigación del cáncer, scRNA-seq analiza la heterogeneidad del tumor y el microambiente del tumor, identificando marcadores raros [estados celulares relacionados con la citometría de flujo] resistentes a los medicamentos (/guides/flow-cytometry.html). La técnica se basa en principios básicos de secuenciación de ARN y conceptos de microarrays de ADN y expresión genética. Los métodos emergentes de transcriptómica espacial ahora añaden contexto posicional a los datos unicelulares, revelando cómo se organizan las células dentro de los tejidos.
Protocolo práctico
Un experimento típico de 10x Genomics scRNA-seq comienza con la preparación de una suspensión unicelular a una concentración de 700 a 1200 células/μl con una viabilidad superior al 90 %. El controlador de cromo divide las células en gel-bead-in-emulsions (GEM) a escala de nanolitros, cada una de las cuales contiene una perla con código de barras con códigos de barras 10x y UMI únicos. Después de la transcripción inversa dentro de GEM, el ADNc con código de barras se agrupa y amplifica. La construcción de la biblioteca implica fragmentación enzimática, reparación de extremos, cola A, ligadura de adaptadores y PCR de índice de muestra. La secuenciación se realiza en una plataforma Illumina con una configuración de lectura de R1 28 ciclos (código de barras 10x y UMI), R2 91 ciclos (inserto de ADNc) y índice i7 de 8 ciclos. La canalización de Cell Ranger procesa archivos BCL sin procesar en FASTQ usando “cellranger mkfastq”, luego alinea las lecturas con el genoma de referencia con STAR a través de “cellranger count”. El resultado incluye matrices de códigos de barras de funciones filtradas, incrustaciones de UMAP y resultados de agrupación. El análisis posterior en R utiliza Seurat: CreateSeuratObject, SCTransform para la normalización, RunPCA y RunUMAP para la reducción de dimensionalidad y FindClusters con el algoritmo de Leiden. En Python, Scanpy proporciona funciones análogas: sc.pp.filter_cells, sc.pp.normalize_total, sc.pp.log1p, sc.tl.pca y sc.tl.leiden. Se recomienda la detección de dobletes con “DoubletFinder” o “scrublet” antes de la agrupación, y la integración por lotes entre muestras se puede realizar con “Harmony” o “scVI”.
