La purificación Strep-tag utiliza una etiqueta peptídica corta (Strep-tag II) que se une específicamente a estreptavidina modificada (Strep-Tactin) para una purificación suave de proteínas en un solo paso en condiciones fisiológicas sin iones metálicos ni agentes reductores.
Principio
La Strep-tag II es una secuencia peptídica de ocho aminoácidos (WSHPQFEK) que imita la interacción de la biotina con la estreptavidina. Se une a Strep-Tactin, una variante modificada de estreptavidina con un bolsillo de unión modificado que acomoda el péptido con alta afinidad (K_d ≈ 1 µM). La unión es reversible: la elución utiliza destiobiotina 2.5 mM, un análogo de la biotina que desplaza competitivamente la etiqueta. La destiobiotina se une más débilmente que la biotina y se elimina durante el intercambio de tampón, permitiendo la regeneración de la resina. Alternativamente, se puede usar biotina 10 mM para elución completa pero impide la reutilización de la resina. Todo el procedimiento es compatible con tampones fisiológicos, preservando la estructura y actividad nativas de la proteína.
Twin-Strep-Tag
La Twin-Strep-tag (dos secuencias Strep-tag II en tándem separadas por un enlazador corto) mejora dramáticamente la afinidad de unión (K_d ≈ 10⁻¹¹ M), permitiendo la captura de proteínas expresadas a niveles muy bajos y la purificación a partir de muestras diluidas. También permite la captura cuantitativa de complejos proteicos. La Twin-Strep-tag se recomienda para dianas difíciles y para la captura por afinidad de parejas de interacción proteica a partir de niveles de expresión endógenos.
Resinas y Formatos
La agarosa Strep-Tactin (IBA Lifesciences, ahora parte de Cube Biotech) ofrece una capacidad de unión de aproximadamente 50 nmol de péptido Strep-tag II por mL (≈1.3 mg de una proteína de 26 kDa). La resina de alto rendimiento Strep-Tactin Superflow es compatible con sistemas de FPLC a caudales de hasta 5 mL/min. Las perlas magnéticas Strep-Tactin están disponibles para purificación a pequeña escala y experimentos de purificación. Strep-TactinXT es una versión mejorada con mayor afinidad por la Strep-tag II convencional, eliminando la necesidad de la Twin-Strep tag más grande en la mayoría de las aplicaciones.
Tampones
Tampón de carga/lavado: Tris-HCl 100 mM pH 8.0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM. Tampón de elución: tampón de carga más destiobiotina 2.5 mM. Tampón de regeneración: HABA (ácido hidroxiazofenil-benzoico) 1 mM o biotina 10 mM en tampón de carga para eliminar proteína residual unida o destiobiotina. El tampón es compatible con agentes reductores (< 2 mM DTT o TCEP) y detergentes suaves (Triton X-100 al 0.1%, NP-40 al 0.05%). Los agentes reductores fuertes (> 10 mM DTT) y las soluciones que contienen biotina (> 2 µM) deben evitarse en el paso de carga, ya que interfieren con la unión.
Protocolo
Equilibrar la resina Strep-Tactin con tampón de carga. Cargar el lisado clarificado (incubación batch 30 min, 4 °C, o columna a 0.5–1 mL/min). Lavar con 10–20 volúmenes de columna de tampón de carga. Eluir con 6–10 volúmenes de columna de tampón de elución (destiobiotina). Si se usa biotina, eluir con 5 volúmenes de columna y tener en cuenta que la resina no puede reutilizarse. Regenerar con tampón HABA o biotina, luego equilibrar para reutilización hasta cinco veces. Recoger fracciones y analizar mediante SDS-PAGE.
Ventajas
La Strep-tag es pequeña (8 aminoácidos, 1 kDa) y rara vez afecta la función proteica, haciendo que la eliminación de la etiqueta sea innecesaria para la mayoría de las aplicaciones. La elución con destiobiotina en condiciones fisiológicas preserva la actividad enzimática, la integridad del complejo y la unión de anticuerpos. El sistema es compatible con His-tag para purificaciones de doble etiqueta. La ausencia de iones metálicos elimina el riesgo de oxidación catalizada por metales. Las aplicaciones incluyen purificación de proteínas recombinantes, aislamiento de complejos proteicos y purificación de parejas de interacción.
