La resonancia de plasmón superficial (SPR) mide la unión y disociación de moléculas en tiempo real sin marcajes fluorescentes o radiactivos. Es el estándar de oro para determinar la afinidad de unión (KD), las tasas de asociación (ka) y las tasas de disociación (kd).
Principio
La SPR detecta cambios en el índice de refracción en una superficie de sensor de oro. Un interactuante (el ligando) se inmoviliza en la superficie del sensor. Una solución que contiene el otro interactuante (el analito) fluye sobre la superficie. A medida que las moléculas de analito se unen al ligando, la masa en la superficie aumenta, cambiando el índice de refracción. Este cambio se mide continuamente y se representa como un sensorgrama (respuesta en unidades de resonancia vs. tiempo).
Sensorgrama
Un experimento típico de SPR consiste en:
- Línea base: el tampón fluye sobre la superficie.
- Asociación: se inyecta el analito; la respuesta aumenta a medida que ocurre la unión.
- Equilibrio: la tasa de unión iguala la tasa de disociación; la respuesta se estabiliza.
- Disociación: el tampón reemplaza al analito; la respuesta disminuye a medida que el complejo se disocia.
Se inyectan múltiples concentraciones de analito sobre la misma superficie de ligando para generar una serie de sensorgramas. El ajuste global de los datos a un modelo de unión 1:1 produce ka, kd y la KD calculada (= kd/ka).
Instrumentación
El Biacore (Cytiva) es la plataforma de SPR más utilizada. El chip sensor tiene una superficie de oro recubierta con una matriz de dextrano carboximetilado que proporciona un ambiente hidrofílico para la inmovilización. Otras plataformas incluyen Sierra Sensors, Reichert y Nicoya.
Métodos de Inmovilización
- Acoplamiento por aminas: el método más común. Los grupos carboxilo en la superficie de dextrano se activan con EDC/NHS para formar ésteres reactivos que reaccionan con aminas primarias del ligando. Simple pero con orientación aleatoria.
- Acoplamiento por captura: una molécula de captura (anticuerpo anti-His, estreptavidina, Proteína A) se acopla por aminas, y el ligando se captura a partir de una preparación cruda o purificada. Esto asegura una orientación uniforme y permite la regeneración de la superficie sin dañar el ligando.
- Biotina-estreptavidina: ligandos biotinilados se capturan en una superficie recubierta de estreptavidina. Estabilidad casi covalente con inmovilización orientada.
Aplicaciones
- Clasificación de afinidad: cribado de clones de anticuerpos para la mayor afinidad.
- Agrupación de epítopos: determinar si dos anticuerpos se unen a epítopos solapantes.
- Análisis de concentración: medición de concentración activa usando un enfoque sin calibración.
- Análisis de moléculas pequeñas: los instrumentos SPR modernos detectan moléculas tan pequeñas como 100 Da.
- Caracterización cinética: determinación completa de ka, kd y KD para candidatos a fármacos.
Limitaciones
La SPR requiere un ligando relativamente puro y conocimiento de la estequiometría de unión. La limitación de transporte de masa (el analito se une más rápido de lo que puede difundirse a la superficie) puede distorsionar la cinética y se aborda usando altas tasas de flujo y bajas densidades de ligando. La unión no específica a la superficie o matriz debe minimizarse optimizando el tampón de corrida (añadiendo surfactante, BSA o glicerol).
