Más allá de la edición básica con CRISPR/Cas9, la ingeniería genómica incluye el cribado funcional masivo y nucleasas alternativas para la modificación precisa de secuencias.

CRISPR Screening

El cribado con CRISPR es un método de genómica funcional de alto rendimiento que utiliza librerías lentivirales agrupadas de ARN guía único (sgRNA) para eliminar cada gen del genoma e identificar aquellos involucrados en un fenotipo de interés.

Un cribado típico:

1. Una librería lentiviral de sgRNA (ej., librería Brunello: 4 sgRNA por gen, 77,000 sgRNA en total) se transduce en células que expresan Cas9 a una multiplicidad de infección baja (~0.3) para asegurar que la mayoría de las células reciban un sgRNA.
2. Las células se someten a una presión de selección: tratamiento con fármacos, exposición a toxinas o un fenotipo basado en clasificación (ej., un reportero para una vía de señalización).
3. Se extrae el ADN genómico, y las secuencias de sgRNA se amplifican por PCR y se cuantifican mediante secuenciación de próxima generación.
4. Los sgRNA empobrecidos o enriquecidos en el grupo tratado en comparación con el control identifican genes esenciales para la supervivencia o resistencia.

Los cribados CRISPR son más sensibles y específicos que los cribados con shRNA porque Cas9 crea eliminaciones completas y tiene menos efectos fuera de diana.

TALEN

Las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) son enzimas de restricción artificiales creadas fusionando un dominio de unión a ADN efector TAL con el dominio nucleasa de FokI. Cada repetición efectora TAL reconoce un par de bases de ADN individual, permitiendo el ensamblaje modular de dominios de unión que se dirigen a cualquier secuencia.

El dominio FokI debe dimerizarse, por lo que los TALEN se usan en pares que flanquean el sitio diana. La dimerización crea una rotura de doble cadena (DSB) en la diana, que se repara mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) — produciendo pequeñas inserciones o deleciones — o mediante reparación dirigida por homología (HDR) si se proporciona una plantilla de reparación.

Los TALEN son más específicos que los primeros sistemas CRISPR pero más laboriosos de construir porque cada nueva diana requiere ensamblar una nueva matriz de repeticiones.

Nucleasas con Dedos de Zinc (ZFN)

Las ZFN fusionan dominios de dedos de zinc (cada uno reconoce ~3 pb) con el dominio nucleasa FokI. Como los TALEN, requieren sitios de unión emparejados y dimerización de FokI para la actividad. Las ZFN fueron las primeras nucleasas dirigidas ampliamente utilizadas pero han sido en gran medida sustituidas por CRISPR y TALEN debido a la dificultad de diseñar matrices de dedos de zinc con alta especificidad.

Selección de un Enfoque

• CRISPR es el más simple y escalable — adecuado para cribados de todo el genoma y edición rutinaria.
• TALEN ofrecen menor edición fuera de diana y son preferidos cuando se necesita reconocimiento preciso de una sola base o cuando se edita en organismos donde las restricciones de PAM de CRISPR son limitantes.
• ZFN siguen siendo útiles en contextos específicos como la terapia génica (donde el tamaño más pequeño ayuda al empaquetamiento viral) y en organismos donde las otras herramientas están menos desarrolladas.