La espectroscopia UV-Vis (Ultravioleta-Visible) es una técnica analítica que mide la absorción de luz en las regiones ultravioleta (190-400 nm) y visible (400-800 nm) del espectro electromagnético. Se utiliza ampliamente para análisis cuantitativos, estudios cinéticos y caracterización de transiciones electrónicas en moléculas.

Principio de absorción UV-Vis

Cuando la luz pasa a través de una muestra, las moléculas absorben fotones cuya energía coincide con la brecha de energía entre los orbitales electrónicos, promoviendo los electrones del estado fundamental a un estado excitado. La cantidad de luz absorbida en cada longitud de onda se registra como un espectro de absorbancia y la longitud de onda de máxima absorción (λmax) es característica de cada cromóforo. La ley de Beer-Lambert (A = εcl) relaciona la absorbancia (A) con la absortividad molar (ε), la longitud del camino (c) y la concentración (l), lo que permite la cuantificación.

Instrumentación

Un espectrómetro UV-Vis consta de varios componentes. Una lámpara de deuterio proporciona luz para el rango ultravioleta y una lámpara halógena de tungsteno para el rango visible. Un monocromador (rejilla de difracción o prisma) selecciona una banda estrecha de longitudes de onda. El compartimento de la muestra contiene una cubeta de cuarzo para mediciones UV o una cubeta de vidrio para mediciones del rango visible, y un detector (tubo fotomultiplicador o conjunto de fotodiodos) convierte la luz transmitida en una señal eléctrica. Los instrumentos de doble haz dividen la luz en haces de muestra y de referencia para corregir las fluctuaciones del disolvente y de la lámpara.

Aplicaciones

La espectroscopia UV-Vis se utiliza para el análisis cuantitativo de ácidos nucleicos (A260), proteínas (A280) y [cinética enzimática] (/guides/enzyme-kinetics.html), determinación de valores de pKa midiendo los cambios de absorbancia con el pH, control de calidad de productos farmacéuticos, colorantes alimentarios y contaminantes del agua, y caracterización de complejos de metales de transición y compuestos orgánicos conjugados.

Ventajas y limitaciones

• Ventajas: Rápido, no destructivo, requiere pequeños volúmenes de muestra y es relativamente económico.
• Limitaciones: Sólo mide especies cromóforas; Las muestras deben ser transparentes y libres de partículas dispersas.

Protocolo práctico de espectroscopía UV-Vis

Caliente el instrumento durante 15 a 30 minutos para estabilizar la lámpara. Seleccione cubetas de cuarzo para mediciones UV (<350 nm), ya que el vidrio y el plástico absorben la luz UV; Utilice cubetas desechables de plástico o vidrio únicamente para mediciones en el rango visible. Maneje las cubetas por los lados esmerilados para evitar huellas dactilares en las ventanas ópticas. Llene una cubeta de referencia con la solución en blanco (el disolvente o el tampón solo) y la cubeta de muestra con la solución del analito. Inserte la cubeta de referencia en la ruta del haz de referencia y la muestra en la ruta del haz de muestra. Para instrumentos de haz único, primero recopile un espectro de referencia del blanco y luego reemplácelo con la muestra. Realice un escaneo de longitud de onda de 200 a 800 nm a velocidad media (200 nm/min) para determinar λmax, la longitud de onda de máxima absorbancia. Para análisis cuantitativo a una longitud de onda fija, ajuste el instrumento al λmax del analito. Mida la absorbancia de una serie de soluciones estándar (5 a 7 concentraciones que abarcan el rango esperado) y la muestra desconocida. Construya una curva de calibración trazando la absorbancia frente a la concentración. Ajuste una regresión lineal: la ley de Beer-Lambert (A = εbc) establece que la relación debe ser lineal con una intersección cercana a cero, siempre que la absorbancia esté entre 0,1 y 1,0 (el rango lineal de la mayoría de los instrumentos). Si la absorbancia excede 1,0, diluya la muestra. Para la cuantificación de ADN a 260 nm, utilice el coeficiente de extinción de 50 ng/l por unidad de OD para ADN bicatenario y 33 ng/l por unidad de OD para ADN monocatenario. La pureza se evalúa mediante la relación A260/A280 (~1,8 para ADN puro, ~2,0 para ARN puro) y la relación A260/A230 (>2,0). Para la cuantificación de proteínas a 280 nm, mida el A280 de una proteína purificada y calcule la concentración utilizando el coeficiente de extinción molar de la proteína. Para la cinética enzimática, controle el cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo a una longitud de onda fija; por ejemplo, el consumo de NADH a 340 nm (ε = 6220 M⁻¹cm⁻¹) para medir la actividad deshidrogenasa.

Aplicación del mundo real

En un estudio de la enzima alcohol deshidrogenasa, la oxidación del etanol a acetaldehído se acopla a la reducción de NAD⁺ a NADH, que se absorbe a 340 nm. La reacción se controla a 340 nm durante 5 minutos a 30 °C con etanol entre 0,1 y 10 mM. Las velocidades iniciales se representan frente a la concentración de sustrato y se ajustan a la ecuación de Michaelis-Menten, lo que produce Km = 1,2 mM y Vmax = 85 µM/min.