La detección precisa y oportuna de infecciones virales es esencial para el manejo clínico, la vigilancia epidemiológica, el control de infecciones y la respuesta de salud pública. El diagnóstico viral ha evolucionado desde el aislamiento de virus tradicional hasta técnicas moleculares altamente sensibles que pueden identificar patógenos en cuestión de horas.

Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la piedra angular del diagnóstico viral molecular. La PCR con transcripción inversa (RT-PCR) convierte el ARN viral en ADN complementario (ADNc) mediante transcriptasa inversa, seguida de amplificación por PCR, lo que la convierte en el estándar de oro para la detección de virus de ARN, incluidos el SARS-CoV-2, la influenza, el VIH y el virus de la hepatitis C. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utiliza sondas fluorescentes para monitorear la amplificación en tiempo real, proporcionando detección y cuantificación de la carga viral. La PCR digital divide la muestra en miles de reacciones individuales, lo que permite una cuantificación absoluta sin curvas estándar y una detección mejorada de objetivos de baja abundancia. Los ensayos de PCR múltiple detectan simultáneamente varios virus en una sola reacción, como paneles de virus respiratorios que analizan la influenza A y B, el virus respiratorio sincitial, el adenovirus y el metapneumovirus humano. Los métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA), amplifican los ácidos nucleicos a temperatura constante, lo que permite realizar pruebas en el lugar de atención sin termocicladores.

Métodos de detección serológica

Las pruebas serológicas detectan anticuerpos producidos por la respuesta inmune del huésped contra antígenos virales, lo que indica una infección actual o pasada. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es el formato más utilizado: el ELISA indirecto detecta anticuerpos antivirales en el suero del paciente y el ELISA sándwich detecta antígenos virales directamente. Las pruebas de diagnóstico rápido (PDR), generalmente basadas en inmunocromatografía de flujo lateral, brindan resultados en 15 a 30 minutos y se usan ampliamente para las pruebas de VIH, dengue y SARS-CoV-2 en el lugar de atención. Los ensayos de neutralización miden la capacidad de los anticuerpos del paciente para bloquear la infección viral en cultivos celulares, proporcionando información funcional sobre la inmunidad protectora que es particularmente importante para la evaluación de vacunas. La transferencia Western se utiliza como prueba de confirmación del VIH y detecta anticuerpos contra proteínas virales específicas como gp120, gp41 y p24.

Métodos de detección de antígenos

Las pruebas directas de antígenos detectan proteínas virales en muestras clínicas y brindan resultados rápidos a un costo menor que los métodos moleculares. Los ensayos de inmunofluorescencia (IFA) utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia para detectar antígenos virales directamente en células o secciones de tejido del paciente, comúnmente utilizados para virus respiratorios (influenza, RSV) y herpesvirus. Los ensayos inmunocromatográficos de flujo lateral, como las pruebas rápidas de antígenos para el SARS-CoV-2, utilizan anticuerpos conjugados con nanopartículas coloreadas que se unen a antígenos virales y producen una línea visible en una tira reactiva. Si bien las pruebas de antígenos son generalmente menos sensibles que los métodos moleculares, son más rápidas, más baratas y más adecuadas para una detección generalizada.

Aislamiento de virus en cultivo celular

El cultivo viral implica inocular muestras clínicas en líneas celulares susceptibles y observar efectos citopáticos (CPE), como la formación de sincitios (virus sincitial respiratorio), el redondeo celular (enterovirus) y la formación de placas (virus de la influenza). El cultivo en vial de cáscara mejora la detección mediante centrifugación del inóculo en la monocapa celular seguida de inmunotinción para antígenos virales después de 24 a 48 horas, en comparación con los 3 a 14 días necesarios para el cultivo tradicional. Si bien el cultivo es lento y requiere instalaciones especializadas, sigue siendo importante para el descubrimiento de virus, las pruebas de susceptibilidad a los antivirales y la producción de reservas virales para la investigación y el desarrollo de vacunas.

Detección basada en microscopía

La microscopía electrónica puede visualizar partículas de virus directamente en muestras clínicas, identificando virus por su morfología característica (icosaédrica (adenovirus, herpesvirus), helicoidal (influenza, Ébola) o compleja (poxvirus) y es particularmente útil para detectar virus desconocidos o inesperados. La microscopía inmunoelectrónica utiliza el etiquetado de anticuerpos para identificar específicamente partículas de virus. Si bien no es adecuada para diagnósticos de rutina debido a costos y requisitos de experiencia, la microscopía electrónica jugó un papel fundamental en el descubrimiento de muchos virus, incluidos el SARS-CoV-1 y el norovirus.

Diagnóstico basado en secuenciación

La secuenciación de próxima generación (NGS) permite la detección imparcial de virus nuevos y conocidos en muestras clínicas sin requerir conocimiento previo de la secuencia del patógeno. La NGS metagenómica secuencia todos los ácidos nucleicos de una muestra, lo que permite la identificación de virus, bacterias, hongos y parásitos simultáneamente. Los paneles de NGS dirigidos se enriquecen con secuencias virales mediante captura de sonda o PCR múltiple antes de la secuenciación, lo que aumenta la sensibilidad para patógenos conocidos. La secuenciación también proporciona información sobre el genotipo viral, mutaciones de resistencia a los medicamentos y relaciones filogenéticas para la investigación de brotes. Si bien sigue siendo costosa y requiere mucha computación, la secuenciación se utiliza cada vez más en el diagnóstico clínico, particularmente para casos complejos en los que las pruebas convencionales son negativas.

Puntos de atención y tecnologías emergentes

Las pruebas en el lugar de atención acercan el diagnóstico viral al paciente, reduciendo el tiempo de respuesta de días a minutos. Los dispositivos de laboratorio en un chip de microfluidos integran la preparación, amplificación y detección de muestras en un solo cartucho, con ejemplos que incluyen el sistema GeneXpert para VIH, tuberculosis y SARS-CoV-2. Los diagnósticos basados en CRISPR (SHERLOCK, DETECTR) utilizan enzimas Cas programadas para reconocer secuencias de ácido nucleico virales específicas, junto con moléculas informadoras que generan una señal fluorescente o colorimétrica, logrando sensibilidad attomolar sin instrumentación compleja. Se están desarrollando biosensores que utilizan nanomateriales, aptámeros y detección electroquímica para una detección viral rápida y portátil.