La cristalografía de rayos X determina la estructura tridimensional atómica de proteínas y otras macromoléculas midiendo los ángulos e intensidades de los rayos X difractados por un cristal, para luego calcular mapas de densidad electrónica a partir de los cuales se construyen modelos atómicos.
Principio
Cuando los rayos X inciden sobre un cristal, son dispersados por las nubes electrónicas de los átomos. La red regularmente espaciada del cristal causa interferencia constructiva — difracción — en ángulos específicos descritos por la ley de Bragg. La medición de las posiciones e intensidades de los puntos de difracción permite reconstruir la distribución de densidad electrónica. Este mapa de densidad se interpreta ajustando un modelo atómico, que se refina contra los datos observados.
Cristalización de Proteínas
La difracción requiere cristales con orden tridimensional regular. La proteína se purifica a >95% de homogeneidad a 5–20 mg/mL. Los cribados de cristalización prueban cientos de condiciones que varían el precipitante (PEG, sulfato de amonio), pH, tampón, sal y aditivos. La difusión de vapor en gota sentada y gota colgante son los métodos estándar. Las gotas de proteína y solución de reservorio se equilibran contra un reservorio más grande, concentrando la proteína y promoviendo la nucleación. Los cristales adecuados para difracción crecen en días a semanas y se recolectan con criobucles.
Recolección de Datos
Los cristales se enfrían rápidamente en nitrógeno líquido a 100 K para reducir el daño por radiación. Los datos de difracción se recolectan en líneas de luz de sincrotrón, que proporcionan haces de rayos X intensos y sintonizables. Un conjunto de datos completo comprende cientos a miles de imágenes de difracción recolectadas mientras el cristal rota a través de un pequeño rango angular por imagen. El procesamiento de datos con XDS, iMosflm o DIALS indexa las reflexiones, integra intensidades y escala las mediciones. Los límites de resolución se definen por las reflexiones de mayor ángulo con intensidad medible; 2.0–3.0 Å es típico para estructuras de proteínas.
Problema de Fase
Las intensidades medidas proporcionan amplitudes pero no fases, que son esenciales para la transformada de Fourier que reconstruye la densidad electrónica. El reemplazo molecular resuelve las fases colocando un modelo de estructura homóloga en la celda unitaria cristalográfica y calculando su difracción predicha, que suministra fases iniciales. Cuando no existe un buen modelo de búsqueda, el faseado experimental utiliza derivados de átomos pesados (MIRAS) o incorporación de selenio mediante selenometionina (MAD/SAD). Los flujos de trabajo modernos automatizan la mayor parte de este proceso.
Construcción y Refinamiento del Modelo
El mapa de densidad electrónica inicial se interpreta en Coot o software similar, donde se traza la cadena polipeptídica y se colocan las cadenas laterales. El modelo se somete a ciclos iterativos de ajuste manual y refinamiento computacional con phenix.refine o REFMAC5. El refinamiento optimiza el modelo para minimizar la diferencia entre los factores de estructura calculados y observados. La calidad se monitoriza mediante Rwork y Rfree. Una estructura fiable típicamente tiene Rfree por debajo de 0.25 a 2.5 Å de resolución.
Validación
MolProbity valida la geometría del esqueleto, valores atípicos de rotámeros, puntuaciones de conflictos y estadísticas de Ramachandran. La correlación entre el modelo y la densidad electrónica experimental se evalúa mediante el factor R de espacio real. El informe de validación del PDB, generado para todos los depósitos, proporciona un resumen de calidad estandarizado. Criterios recomendados: >90% Ramachandran favorecidos, <0.3% valores atípicos de Ramachandran, <1% valores atípicos de rotámeros.
Aplicaciones
La cristalografía de rayos X ha determinado la mayoría de las estructuras proteicas conocidas en el Protein Data Bank. Ha dilucidado mecanismos catalíticos enzimáticos, interacciones fármaco-diana incluyendo la proteasa del VIH e inhibidores de quinasas, y grandes complejos macromoleculares como el ribosoma. Junto con la espectroscopia NMR y la crio-EM, forma el núcleo de herramientas de la biología estructural.
