La zimografía es una técnica electroforética que detecta la actividad enzimática de proteasas, lipasas, glicosidasas y otras enzimas hidrolíticas. La aplicación más común es la detección de actividad de metaloproteinasas de matriz (MMP) en muestras biológicas.

Principio

Una muestra de proteína se separa mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras (sin DTT ni β-mercaptoetanol, estos destruirían la actividad enzimática). El gel separador se co-polimeriza con un sustrato, típicamente gelatina (0.1% p/v) para detección de MMP-2 y MMP-9, o caseína para detección más amplia de proteasas. Después de la electroforesis, el SDS se elimina lavando en una solución de Triton X-100, permitiendo que las proteasas se renaturalicen. El gel se incuba luego en un tampón de desarrollo a 37 °C durante 12–48 horas, durante el cual las proteasas activas digieren el sustrato en su vecindad inmediata. Después de teñir con Azul de Coomassie, aparecen bandas claras contra un fondo azul oscuro donde el sustrato ha sido digerido.

Protocolo

1. Prepare el gel separador con gelatina o caseína al 0.1% añadida a la solución de acrilamida (8–10% de acrilamida es estándar para MMP). Incluya un gel concentrador sin sustrato.
2. Cargue muestras sin hervir y sin agentes reductores. Use un tampón de muestra no reductor (Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8, glicerol al 25%, SDS al 2%, azul de bromofenol al 0.01%).
3. Corra a 100–150 V a 4 °C para prevenir proteólisis durante la electroforesis.
4. Lave el gel en tampón de renaturalización (Triton X-100 al 2.5% en Tris-HCl 50 mM pH 7.5) durante 2 × 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
5. Lave brevemente en tampón de desarrollo (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, CaCl₂ 10 mM, NaCl 150 mM, NaN₃ al 0.02%, ZnCl₂ 1 µM).
6. Incube en tampón de desarrollo a 37 °C durante 12–48 horas.
7. Tiña con Azul de Coomassie R-250 (0.5% en metanol al 30%, ácido acético al 10%) durante 1 hora.
8. Decolore (metanol al 30%, ácido acético al 10%) hasta que las bandas claras sean visibles.
9. Capture imagen del gel y cuantifique las bandas por densitometría.

Interpretación

Las bandas aparecen como zonas claras sobre un fondo azul. Su posición indica el peso molecular (por comparación con estándares de proteína), y su intensidad es proporcional a la cantidad de enzima activa. El peso molecular de la banda clara debe corresponder a la forma pro-enzima o activa de la proteasa esperada. Por ejemplo, pro-MMP-9 aparece a ~92 kDa, MMP-9 activa a ~82 kDa, pro-MMP-2 a ~72 kDa y MMP-2 activa a ~62 kDa.

Zimografía Inversa

Para detectar inhibidores de proteasas (TIMP, inhibidores tisulares de metaloproteinasas), el gel se co-polimeriza tanto con sustrato como con una proteasa estándar (ej., medio acondicionado de células HT-1080 que contiene MMP activas). Después del desarrollo y tinción, las bandas de inhibidor aparecen como áreas oscuras (teñidas) donde el sustrato no fue digerido, contra un fondo claro donde la proteasa añadida digirió el sustrato en todas partes.

Aplicaciones

La zimografía se utiliza para medir la actividad de MMP en extractos tumorales, líquido de heridas, líquido sinovial y sobrenadantes de cultivo celular. Es un ensayo estándar en biología del cáncer (las MMP promueven la invasión y metástasis), enfermedad cardiovascular (remodelación de placa) y remodelación tisular. La zimografía cuantitativa es posible con estándares de MMP purificados cargados en el mismo gel.

Limitaciones

La zimografía detecta la actividad proteolítica total a ese peso molecular, no necesariamente una sola enzima, múltiples proteasas pueden co-migrar. Tampoco es verdaderamente cuantitativa en un sentido absoluto (la cinética de digestión del sustrato varía entre enzimas). Para mediciones de actividad específica, se prefieren ensayos de actividad basados en ELISA o ensayos de escisión de sustratos FRET.