Ikhtisar
Proteomik bertarget berfokus pada penghitungan sekumpulan protein yang telah ditentukan sebelumnya dengan sensitivitas, spesifisitas, dan hasil yang tinggi, berbeda dengan proteomik penemuan yang bertujuan untuk cakupan luas dan tidak bertarget. Teknik yang paling banyak digunakan adalah pemantauan reaksi terpilih (SRM, juga disebut pemantauan reaksi berganda atau MRM) yang dilakukan pada spektrometer massa triple quadrupole. Uji SRM menargetkan transisi peptida-prekursor-ke-fragmen spesifik, yang dikenal sebagai peptida proteotipik, yang secara unik mewakili protein yang diinginkan. Pendekatan ini memberikan presisi kuantitatif yang sebanding dengan immunoassay sekaligus menawarkan kemampuan multiplexing yang lebih tinggi dan pengembangan pengujian yang lebih cepat.
Metode
Pengembangan pengujian dimulai dengan pemilihan peptida proteotipik: peptida yang unik untuk protein target, dapat terbang dengan baik dalam spektrometer massa, dan menghasilkan ion fragmen yang kuat. Untuk setiap peptida, beberapa transisi (ion prekursor m/z ke ion fragmen m/z) dipantau sepanjang periode elusi kromatografi. Standar internal, biasanya versi peptida target berlabel isotop stabil, dimasukkan ke dalam sampel pada konsentrasi yang diketahui untuk memungkinkan kuantifikasi absolut. Pemantauan reaksi paralel (PRM) pada instrumen Orbitrap menawarkan pendekatan serupa dengan akuisisi spektrum penuh resolusi tinggi. Metode akuisisi data-independen (DIA) seperti SWATH-MS menjembatani kesenjangan antara penemuan dan analisis yang ditargetkan dengan mencatat semua ion fragmen dari semua prekursor secara sistematis.
Protokol Praktis
Mengembangkan uji SRM/MRM dimulai dengan mengidentifikasi peptida proteotipik untuk protein target. Dengan menggunakan perpustakaan spektral dari PeptideAtlas atau SRMAtlas, peneliti memilih peptida dengan panjang 7-25 asam amino, tidak memiliki situs pembelahan yang terlewat, menghindari metionin dan triptofan (yang rentan terhadap oksidasi), dan menghasilkan fragmen ion y atau b yang kuat dari data spektrometri massa. Untuk setiap peptida, 3-5 transisi dipilih - 3-5 ion fragmen paling intens teratas dari spektrum perpustakaan. Peptida standar berlabel isotop berat disintesis untuk setiap target, menggabungkan arginin atau lisin berlabel 13C/15N untuk menghasilkan pergeseran massa 6-10 Da. Standar berat dimasukkan ke dalam setiap sampel pada konsentrasi yang diketahui sebelum atau setelah pencernaan, bergantung pada strategi kuantifikasi. Spektrometer massa kuadrupol rangkap tiga dikonfigurasikan dengan Q1 dan Q3 yang masing-masing mentransmisikan nilai m/z prekursor dan fragmen, sementara Q2 melakukan fragmentasi akibat tumbukan pada energi tumbukan yang dioptimalkan khusus untuk setiap transisi. SRM terjadwal memantau setiap transisi dalam jangka waktu retensi 2-3 menit, memaksimalkan jumlah peptida yang diukur per proses. Data mentah diproses di Skyline: puncak kromatografi diintegrasikan, waktu retensi dikonfirmasi terhadap standar internal berat, dan rasio area puncak ringan hingga berat dihitung. Konsentrasi absolut diperoleh dari rasio ini dan konsentrasi standar yang diketahui. Contoh nyata: uji MRM multipleks yang mengkuantifikasi 50 protein terkait kanker dalam plasma dikembangkan untuk deteksi dini kanker paru-paru non-sel kecil, sehingga mencapai batas deteksi di bawah 1 ng/mL untuk 35 dari 50 target. Pengujian ini divalidasi pada 500 sampel pasien dengan koefisien variasi di bawah 15%.
Aplikasi
Proteomik yang ditargetkan adalah metode pilihan untuk memverifikasi dan memvalidasi kandidat biomarker yang ditemukan dalam penelitian yang tidak ditargetkan. Ini digunakan secara luas dalam penelitian klinis untuk mengukur panel protein yang terkait dengan penyakit tertentu. Pengujian ini melengkapi pengukuran ELISA tradisional, menawarkan alternatif terhadap pendekatan berbasis gel, dan dapat digandakan untuk melacak lusinan protein dalam sekali proses. Integrasi dengan pemisahan HPLC dan deteksi spektrometri massa memastikan kuantifikasi yang kuat, sementara pengujian kuantifikasi protein memberikan validasi ortogonal terhadap konsentrasi protein total.
