染色质免疫沉淀是一种绘制基因组中蛋白质-DNA 相互作用图谱的方法。它可以识别转录因子、具有特定修饰的组蛋白和其他染色质相关蛋白的基因组结合位点，从而提供对基因调控和染色质结构的深入了解。

基本原理

ChIP 首先将蛋白质与活细胞中的 DNA 交联，通常使用甲醛，在蛋白质和 DNA 之间在几埃内形成共价交联。通过超声处理或酶消化将交联的染色质剪切成 200 至 600 个碱基对的片段。使用针对目标蛋白质的特异性抗体来免疫沉淀蛋白质-DNA 复合物。交联被逆转，DNA 被纯化。然后通过定量 PCR、微阵列或测序来鉴定富集的 DNA 片段。

交联

甲醛交联是标准方法，在紧密相互作用的氨基之间形成亚甲基桥。它通过热可逆，并且对直接接触 DNA 的蛋白质有效。对于间接或弱结合 DNA 的蛋白质，可以使用替代交联剂，例如乙二醇双琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。天然 ChIP 省略了交联，适用于紧密结合的蛋白质，例如组蛋白。

染色质剪切

超声处理通过机械剪切产生随机 DNA 片段。片段大小分布至关重要，因为较小的片段提供更高分辨率的结合位点。必须针对每种细胞类型优化超声处理条件，以避免过度剪切或剪切不足。使用微球菌核酸酶进行酶消化是天然 ChIP 的替代方案，可在核小体之间切割 DNA。

免疫沉淀

ChIP 的成功取决于抗体质量。抗体必须以高特异性和亲和力识别交联染色质中的靶标。 ChIP 级抗体已针对此应用进行了验证。 [Protein A 或 Protein G 琼脂糖或磁珠](/guides/protein-ag-purification.html)用于捕获抗体-染色质复合物。磁珠是较低背景和更快处理的首选。

ChIP-qPCR

对于已知的靶基因，ChIP-qPCR（定量 PCR）可量化特定基因组区域的富集。引物针对可疑的结合位点和阴性对照区域而设计。富集计算为相对于阴性对照或输入染色质的倍数增加。 ChIP-qPCR 灵敏、定量，适合对选定基因座进行假设驱动的研究。

片上芯片

基于微阵列的 ChIP 将富含 ChIP 的 DNA 与覆盖感兴趣基因组区域的平铺微阵列杂交。输入 DNA 用一种荧光团标记，ChIP DNA 用另一种荧光团标记。具有高比率的基因组区域对应于结合位点。分辨率受到片段大小和探针间距的限制。 ChIP-on-chip 已很大程度上被 ChIP-seq 取代。

ChIP 测序

ChIP-seq 将 ChIP 与[下一代测序](/guides/next- Generation-sequencing.html) 相结合。对免疫沉淀的 DNA 片段进行测序，并将读数与参考基因组进行比对。具有统计显着读数富集的区域（称为峰）表示蛋白质结合位点。 ChIP-seq 提供更高的分辨率、更低的噪音和全基因组覆盖，无需预定义的探针。 MACS 等峰值检出算法可识别读数密度显着超过背景分布的区域。

数据分析

ChIP-seq 数据分析从质量控制、读数比对和去除 PCR 重复项开始。峰值检出使用泊松或负二项式模型来识别富集区域。多重测试校正控制错误发现率。下游分析包括附近基因的峰注释、识别序列偏好的基序发现以及不同条件下的比较。

应用程序

ChIP-seq 绘制了全基因组转录因子结合位点的图谱，揭示了控制基因表达的调控网络。它绘制了定义活性启动子、增强子和抑制染色质的组蛋白修饰模式。 RNA 聚合酶 II 的 ChIP-seq 可识别转录基因和暂停的聚合酶。 ENCODE 和 Roadmap Epigenomics 项目生成了数千个 ChIP-seq 数据集，创建了人类基因组监管格局的综合图谱。