质粒纯化，也称为小量制备，是一种用于从细菌细胞中分离小环状 DNA 分子（质粒）的技术。质粒通常用作分子克隆中的载体，纯化它们对于测序、转染和进一步操作至关重要。
质粒纯化的工作原理
- 细菌培养
含有所需质粒的单个细菌菌落在含有适当抗生素的液体培养基中生长过夜。这确保细菌保留质粒并产生足够的提取物。
- 细胞收获和裂解
将细菌培养物离心以沉淀细胞。将沉淀重悬于含有 RNase（以消化 RNA）的缓冲液中，然后用含有 SDS 和氢氧化钠的碱性裂解液处理。这会破坏细胞并使 DNA 变性。
- 中和
添加含有乙酸钾的中和缓冲液。高盐浓度导致变性的染色体 DNA 和蛋白质沉淀，而较小的超螺旋质粒 DNA 保留在溶液中。离心混合物，并收集含有质粒的上清液。
- 装订和洗涤
在导致质粒 DNA 结合的条件下使上清液通过硅胶膜柱。洗涤缓冲液可去除残留的污染物，例如盐、蛋白质和 RNA。
- 洗脱
使用低盐缓冲液或水将纯化的质粒 DNA 从膜上释放。所得 DNA 的纯度足以用于测序、限制性消化或真核细胞转染。
实用小量制备方案（碱性裂解）
将单个细菌菌落接种到含有适当抗生素的 3–5 mL LB 培养基中，并在 37°C 下以 220 rpm 摇动孵育 12–16 小时。将 1.5–2 mL 培养物以 8,000 × g 离心 2 分钟，收获细胞。弃去上清液，将沉淀重新悬浮在 250 µL 重悬缓冲液中（P1，含有 50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA 和 100 µg/mL RNase A）。添加 250 µL 裂解缓冲液（P2、200 mM NaOH、1% SDS），轻轻颠倒 4-6 次混匀，然后在室温下孵育 3 分钟 — 不要涡旋或超过 5 分钟。添加 350 µL 中和缓冲液（P3，3 M 醋酸钾 pH 5.5），立即翻转混合，并在冰上孵育 5 分钟。 13,000 × g 离心 10 分钟。将澄清的上清液转移至硅胶膜柱中。 13,000 × g 离心 1 分钟，弃去流出液。用 750 µL 洗涤缓冲液（含乙醇）洗涤并离心 1 分钟。重复第二次洗涤。离心 2 分钟干燥柱子。孵育 2 分钟后，离心 1 分钟，用 30–50 µL 洗脱缓冲液 (10 mM Tris-HCl pH 8.5) 或无核酸酶水洗脱 DNA。通过紫外分光光度法评估产量 - 典型的 5 mL 培养物可产生 5–15 µg 质粒 DNA，其中 A260/A280 > 1.8 且 A260/A230 > 2.0。对于低拷贝质粒，将培养体积增加至 10 mL 或使用低拷贝特异性纯化试剂盒。
实际应用
将 1.5 kb 插入片段克隆到 pET-28a 后，会生长 6 个阳性菌落用于小量制备。 A260 读数显示每次制备的产量为 8–12 µg。使用 NcoI 和 XhoI 进行限制性消化，确认了所有 6 个样品中的插入片段。纯化的质粒被送去桑格测序，返回没有背景噪音的高质量色谱图。
