Das Spektrophotometer ist das gebräuchlichste Instrument in jedem Labor. Es misst, wie viel Licht eine Probe bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert, was proportional zur Konzentration der absorbierenden Substanz ist.

Das Lambert-Beersche Gesetz

Die grundlegende Beziehung lautet:

A = ε × b × c

wobei A die Absorption (ohne Einheit), ε der molare Absorptionskoeffizient (L·mol⁻¹·cm⁻¹), b die Schichtdicke (cm) und c die Konzentration (mol/L) ist. Das Gesetz gilt für verdünnte Lösungen (typischerweise A < 1,5). Bei höheren Konzentrationen treten Abweichungen aufgrund molekularer Wechselwirkungen und instrumentellen Streulichts auf.

Gerätekomponenten

• Lichtquelle: Deuteriumlampe für UV (190–350 nm), Wolfram-Halogenlampe für sichtbares Licht (350–900 nm). Xenon-Blitzlampen werden in einigen modernen Instrumenten verwendet.
• Monochromator: Ein Gitter oder Prisma, das einen schmalen Wellenlängenbereich auswählt. Die Bandbreite beeinflusst die Messqualität — schmalere Bandbreite ergibt bessere Linearität.
• Probenkammer: Nimmt die Küvette auf. Die meisten Instrumente akzeptieren Küvetten mit 1 cm Schichtdicke. Küvetten sind aus Quarz (für UV) oder Glas/Kunststoff (nur für sichtbares Licht).
• Detektor: Ein Photomultiplier oder eine Photodiode, die durchgelassenes Licht in ein elektrisches Signal umwandelt.

Bedienschritte

1. Schalten Sie das Gerät ein und lassen Sie die Lichtquelle aufwärmen (15–30 Minuten für Deuteriumlampen).
2. Wählen Sie die Messwellenlänge.
3. Befüllen Sie eine Küvette mit der Blindlösung (das Lösungsmittel ohne Analyt).
4. Platzieren Sie die Blindprobe im Probenhalter und setzen Sie die Absorption auf Null (Autonull).
5. Messen Sie die Probe und notieren Sie die Absorption.
6. Nullen Sie bei mehreren Proben regelmäßig mit der Blindprobe nach.

Küvettenhandhabung

Halten Sie Küvetten an den mattierten oder geriffelten Seiten — Fingerabdrücke auf den optischen Fenstern streuen Licht und erhöhen die Absorption. Spülen Sie Küvetten vor dem Befüllen mit der Probenlösung. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Lichtweg befinden.

Häufige Anwendungen

• Nukleinsäurequantifizierung: A₂₆₀-Messung (1 OD₂₆₀ ≈ 50 µg/mL dsDNA, 40 µg/mL RNA, 33 µg/mL ssDNA). Reinheit wird durch das A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis beurteilt (≈1,8 für reine DNA, ≈2,0 für reine RNA).
• Proteinquantifizierung: Bradford-, BCA- und Lowry-Assays verwenden alle sichtbare Spektrophotometrie.
• Enzymkinetik: Kontinuierliche Messung des NADH-Verbrauchs bei 340 nm oder der Produktbildung bei einer bestimmten Wellenlänge.
• Bakterielle Wachstumskurven: Trübung gemessen bei 600 nm (OD₆₀₀).
• Kolorimetrische chemische Tests: Nahezu jeder Analyt kann gemessen werden, wenn er unter Bildung eines farbigen Produkts reagiert.