ATAC-Seq es un método para identificar regiones de cromatina abierta, áreas del genoma donde el ADN no está firmemente enrollado alrededor de nucleosomas y es accesible a factores de transcripción y otras proteínas reguladoras.

Principio

Un derivado hiperactivo de la transposasa Tn5 (complejo transposoma Tn5) simultáneamente fragmenta y etiqueta el ADN accesible con adaptadores de secuenciación en un proceso llamado tagmentación. Las regiones de cromatina abierta son preferentemente cortadas y etiquetadas por Tn5 porque el ADN unido a nucleosomas es físicamente inaccesible. Los fragmentos etiquetados se amplifican luego por PCR y se secuencian.

Protocolo

1. Cosechar 50,000 células viables (el mínimo recomendado). Para experimentos de baja entrada, se pueden usar tan solo 500 células.
2. Lisar células en tampón de lisis frío (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0.1% IGEPAL CA-630) durante 10 minutos en hielo para aislar núcleos intactos.
3. Pelletizar núcleos y resuspender en mezcla de reacción de transposición que contiene transposoma Tn5 cargado con adaptadores compatibles con Illumina.
4. Incubar a 37 °C durante 30 minutos con mezcla suave.
5. Purificar el ADN tagmentado usando una columna o perlas.
6. Amplificar por PCR durante 10–15 ciclos, incorporando índices de código de barras.
7. Secuenciar en una plataforma Illumina (paired-end 50 pb es estándar).

Análisis de Datos

Las lecturas crudas se:

1. Recortan de secuencias adaptadoras y se alinean al genoma de referencia.
2. Filtran para eliminar lecturas mitocondriales (que pueden comprender 30–50% de las lecturas).
3. Corrigen por sesgo de inserción de Tn5 (Tn5 tiene una preferencia de secuencia débil por ciertos dinucleótidos).
4. Determinan picos de cromatina abierta con MACS2 o Genrich.
5. Anotan para identificar picos en promotores, potenciadores, sitios de unión CTCF y otros elementos reguladores.

Los picos resultantes definen el paisaje de cromatina accesible. La accesibilidad diferencial entre condiciones identifica elementos reguladores que cambian su actividad durante la diferenciación, progresión de enfermedad o tratamiento farmacológico.

Control de Calidad

• Distribución de tamaño de fragmentos: Tn5 produce fragmentos de dos tamaños. Los fragmentos libres de nucleosomas son <100 pb, los mononucleosómicos son 180–247 pb y los dinucleosómicos son 315–400 pb. Una buena biblioteca ATAC-Seq muestra un patrón de escalera de nucleosomas claro.
• Fracción de lecturas en picos (FRiP): una puntuación FRiP >0.3 indica buena relación señal-ruido.
• Enriquecimiento en sitios de inicio de transcripción (TSS): las lecturas deben estar enriquecidas en TSS. Una puntuación de enriquecimiento TSS >5 indica buena calidad.

Aplicaciones

ATAC-Seq se utiliza para identificar elementos reguladores (promotores, potenciadores, silenciadores), estudiar el footprinting de factores de transcripción y perfilar la dinámica de la cromatina en diferentes estados y tipos celulares. El ATAC-Seq de célula única (scATAC-Seq) extiende el método a células individuales, revelando paisajes reguladores específicos de tipo celular en tejidos heterogéneos.

Comparación con DNase-Seq y MNase-Seq

ATAC-Seq requiere 10–100× menos células que DNase-Seq (50,000 vs. 10–50 millones), toma 1–2 días en lugar de 3–4 días, y tiene un flujo de trabajo más simple (una enzima en lugar de titulación con DNasa I). MNase-Seq mapea posiciones de nucleosomas (no cromatina abierta) y requiere 10–50 millones de células. ATAC-Seq ha reemplazado en gran medida a ambos métodos para el perfilado de rutina de accesibilidad de cromatina.