Después de la fijación, el tejido debe infiltrarse con un medio de soporte (normalmente cera de parafina) para permitir un corte fino. Los procesadores de tejidos automatizados transportan el tejido a través de baños de reactivos secuenciales durante 8 a 24 horas, reemplazando el agua con parafina a través de tres etapas: deshidratación, limpieza e infiltración.
El procesador de tejidos
Los procesadores de tejidos modernos son instrumentos cerrados y ventilados que mueven cestas de casetes de tejido a través de una serie de estaciones de reactivos. Procesadores tipo carrusel (Leica ASP300, Thermo Excelsior) rotan la cesta a través de contenedores de reactivos individuales. Procesadores de inmersión y rotación bajan la canasta a una única retorta que se llena y drena secuencialmente con cada reactivo. Ambos tipos incluyen un ciclo de vacío/presión durante la infiltración de parafina que fuerza la cera hacia las cavidades del tejido y elimina el aire residual.
Los procesadores contienen entre 100 y 400 casetes por ejecución. Un protocolo típico nocturno (de 14 a 16 horas) procesa todas las biopsias de rutina y pequeñas resecciones. Se utiliza un protocolo “rápido” más corto (de 4 a 8 horas) para el procesamiento en el mismo día de muestras urgentes, restos de sección congelada y biopsias pequeñas. El protocolo se selecciona en función del tipo y tamaño del tejido.
Deshidratación
El agua es inmiscible con la parafina y debe eliminarse por completo. La deshidratación utiliza etanoles graduados (70%, 80%, 95%, 100%) en concentraciones crecientes. Comenzar con etanol al 70% previene el shock osmótico y la contracción excesiva. El paso de etanol 100% es el más crítico: cualquier agua residual evitará la infiltración de parafina y producirá bloques quebradizos y difíciles de seccionar. El etanol absoluto contiene <1% de agua; debe cambiarse con frecuencia (cada 50 a 100 ejecuciones) para mantener la eficacia.
Artefactos de deshidratación: deshidratación incompleta (bloques granulados y blandos), sobredeshidratación (contracción y endurecimiento excesivos de biopsias pequeñas) y arrastre de agua del etanol al agente de limpieza (reactivos de limpieza turbios).
Limpieza
Los agentes aclaradores son miscibles tanto con etanol como con parafina. Reemplazan el etanol en el tejido y hacen que la muestra sea translúcida (de ahí el “aclaramiento”: el tejido parece claro cuando el índice de refracción coincide con el agente aclarador). Xileno es el agente limpiador universal; funciona bien pero requiere manipulación como un solvente peligroso (neurotóxico, inflamable). Los sustitutos incluyen isopropanol, agentes aclaradores a base de limoneno (HistoClear, Citrisolv) y ftalato de dibutilo. Los sustitutos del xileno se aclaran más lentamente y pueden dejar agente limpiador residual en el tejido.
Artefactos de limpieza: limpieza incompleta (manchas blancas opacas en el bloque; el tejido todavía contiene etanol o agua) y limpieza excesiva (endurecimiento excesivo, particularmente de los tejidos grasos).
Infiltración de parafina
El agente clarificante se reemplaza gradualmente con cera de parafina fundida (punto de fusión 56-60°C). El procesador mueve la cesta a través de dos o tres baños de parafina, cada 1 o 2 horas, al vacío. La infiltración al vacío (15 a 25 pulgadas Hg) elimina el agente limpiador residual y el aire de las cavidades del tejido, asegurando una penetración completa. La parafina fresca en la estación final produce los bloques más limpios.
La calidad de la parafina afecta el seccionamiento. Los aditivos de parafina incluyen DMSO (mejora la infiltración), resinas (mejoran el corte de tejidos duros) y polímeros plásticos (mejoran la continuidad de la cinta). La parafina ideal tiene un rango de fusión estrecho, buena adhesión al tejido y formación mínima de cristales cuando se enfría.
Selección de protocolo
Protocolo de rutina (durante la noche, 14 a 16 horas): adecuado para la mayoría de biopsias y resecciones pequeñas (hasta 4 mm de espesor). Tiempos de reactivo: 70% etanol (1 h), 80% etanol (1 h), 95% etanol (1 h × 2), 100% etanol (1,5 h × 2), xileno (1,5 h × 2), parafina (2 h × 2 con vacío).
Protocolo para muestras grandes (24 horas): para muestras grasas, densas o de >4 mm. Pasos de deshidratación más largos (2 h cada uno), pasos adicionales de xileno (6-8 horas en total) e infiltración extendida de parafina (4 h × 2). El tejido graso requiere una limpieza prolongada porque la grasa se disuelve lentamente en xileno.
Protocolo rápido (4-6 horas): para pequeñas biopsias urgentes. Utiliza temperaturas más altas (60°C), tiempos más cortos y deshidratantes más fuertes (isopropanol). Puede producir bloques más duros pero de morfología adecuada.
Solución de problemas de procesamiento
Bloques blandos o blandos: deshidratación incompleta o infiltración inadecuada de parafina. Vuelva a procesar el tejido derritiendo la parafina y repitiendo con etanol al 100%.
Bloques frágiles: deshidratación excesiva, calor excesivo o exposición prolongada al xileno. Reducir los tiempos de deshidratación o disminuir la temperatura del horno. Agregue una gota de agente humectante al baño de agua durante el corte.
Contracción del tejido: el procesamiento normal provoca una contracción lineal del 10 al 15 %. La contracción excesiva se debe a altas concentraciones de etanol aplicadas demasiado pronto; garantice una deshidratación gradual a partir del 70 %.
Áreas blancas y calcáreas en el bloque: limpieza incompleta (agua residual o etanol). Reprocesar desde la etapa de limpieza.
Control de calidad
Supervise la calidad del procesamiento comprobando la apariencia del bloque (parafina uniforme y translúcida sin manchas blancas), la calidad del corte (cintas suaves sin vibraciones ni desgarros) y la calidad H&E (detalles nucleares nítidos sin palidez excesiva). La pureza del reactivo se verifica mediante la gravedad específica (etanol), el índice de refracción o las pruebas de procesamiento de tejidos. El mantenimiento regular del procesador (limpieza de líneas de reactivos, reemplazo de sellos, calibración de temperatura y vacío) previene fallas en los lotes. Documente todos los cambios y el mantenimiento de los reactivos en el registro de control de calidad.
