Cuantificar ADN y ARN con precisión es un requisito previo para la biología molecular reproducible. Dos enfoques principales dominan: espectrofotometría y fluorometría.

Espectrofotometría UV (NanoDrop)

El espectrofotómetro NanoDrop mide 1–2 µL de muestra colocada directamente sobre un pedestal, usando la tensión superficial para crear una longitud de camino definida (0.2–1.0 mm). Mide la absorbancia a 230, 260 y 280 nm:

• A₂₆₀ mide la concentración de ácidos nucleicos. Para ADNdc, 1 DO₂₆₀ = 50 ng/µL; para ARN, 1 DO₂₆₀ = 40 ng/µL; para ADNmc, 1 DO₂₆₀ = 33 ng/µL.
• A₂₈₀ mide contaminación por proteínas y fenol. Una muestra de ADN pura tiene una relación A₂₆₀/A₂₈₀ de ~1.8; ARN puro ~2.0.
• A₂₃₀ mide compuestos orgánicos, sales caotrópicas y fenol. La relación A₂₆₀/A₂₃₀ debe ser ~2.0–2.2 para ácidos nucleicos puros.

El NanoDrop es rápido y requiere muestra mínima pero no puede distinguir ADN de ARN y se ve afectado por nucleótidos, fragmentos de cadena sencilla y otros contaminantes que absorben UV.

Cuantificación Fluorométrica (Qubit)

El fluorómetro Qubit usa colorantes fluorescentes que se unen específicamente a ADNdc, ARN o proteína. Cuando se unen, el colorante fluoresce intensamente, y la intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración.

Los ensayos Qubit son altamente selectivos — el ensayo de ADNdc no detecta ADNmc o ARN, y el ensayo de ARN no detecta ADN. También son más sensibles que la espectrofotometría, detectando concentraciones tan bajas como 0.1 ng/µL. La compensación es el costo por ensayo (los reactivos están basados en colorantes) y la necesidad de dos estándares de calibración por ensayo.

Selección de un Método

Use espectrofotometría para cuantificación rutinaria de ADN plasmídico purificado, productos de PCR sin contaminación proteica y verificación de relaciones de pureza. Use fluorometría para muestras valiosas (preparación de librerías NGS, ADN de ChIP), cuando la muestra contiene nucleótidos o fragmentos degradados, o cuando necesita cuantificar específicamente ADNdc en presencia de ARN.

Cuantificación en Gel de Agarosa

Para evaluación semicuantitativa, corra la muestra en un gel de agarosa junto a un marcador con intensidades de banda conocidas (ej., 100 ng, 50 ng, 25 ng). La intensidad de fluorescencia de bromuro de etidio o SYBR Safe se correlaciona aproximadamente con la masa. Los sistemas de imagen de gel digitales pueden integrar la intensidad de la banda para una estimación, pero este método es menos preciso que la espectrofotometría o fluorometría.