El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es un inmunoensayo basado en placas que se utiliza para detectar y cuantificar proteínas, anticuerpos, hormonas y otras moléculas específicas. Combina la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de la detección basada en enzimas.
Cómo funciona ELISA
- Recubrimiento
Una placa de microtitulación se recubre con un antígeno o anticuerpo de captura. La molécula objetivo se une a la superficie mediante adsorción pasiva. La placa se incuba durante la noche y luego se lava para eliminar el material no unido.
- Bloqueo
Se añade a los pocillos una solución de bloqueo que contiene una proteína irrelevante como BSA o caseína. Esto cubre los sitios de unión restantes en la superficie de la placa, evitando la unión no específica en pasos posteriores.
- Anticuerpo de detección
Se añade un anticuerpo de detección conjugado con una enzima, más comúnmente peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP). En un ELISA tipo sándwich, un anticuerpo primario se une al objetivo y un anticuerpo secundario ligado a una enzima se une al primario.
- Generación de señal
Se añade un sustrato para la enzima. La enzima convierte el sustrato en un producto coloreado, fluorescente o luminiscente. Se deja que la reacción prosiga durante un tiempo determinado y luego se detiene.
- Medición
La señal se mide mediante un lector de placas. La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de molécula objetivo en la muestra. Una curva estándar que utiliza concentraciones conocidas permite la cuantificación.
- Formatos ELISA
- ELISA directo: El antígeno está recubierto y un anticuerpo ligado a enzima lo detecta directamente.
- ELISA indirecto: Se recubre el antígeno, se une un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario ligado a una enzima lo detecta.
- ELISA sándwich: se recubre un anticuerpo de captura, el antígeno se une y un anticuerpo de detección completa el sándwich.
- ELISA competitivo: la señal disminuye a medida que aumenta la concentración objetivo.
Protocolo práctico ELISA tipo sándwich
Cubra una placa de microtitulación de alta unión de 96 pocillos con 100 l/pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento (tampón carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,6) a una concentración de 1 a 5 g/ml. Incubar durante la noche a 4°C. Lavar la placa 3 veces con 300 l/pocillo de PBST (PBS + 0,05% Tween-20) utilizando un lavador de placas o una pipeta multicanal. Bloquee cada pocillo con 200 l de tampón de bloqueo (PBST que contiene 3% de BSA o 5% de leche en polvo descremada) durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar 3 veces. Agregue 100 µl/pocillo de estándares (diluciones en serie de la proteína objetivo, normalmente 7 concentraciones que van desde 1000 pg/ml a 15 pg/ml) y muestras, cada una por duplicado. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar 5 veces. Agregue 100 µl/pocillo de anticuerpo de detección (biotinilado o directamente conjugado con enzima) a la concentración optimizada (normalmente 0,5–2 µg/ml). Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar 5 veces. Si utiliza un anticuerpo de detección biotinilado (véase sistemas biotina-avidina), agregue 100 µl/pocillo de estreptavidina-HRP (1:2000) durante 30 minutos y lave 5 veces. Agregue 100 µl/pocillo de solución de sustrato TMB e incube en la oscuridad durante 15 a 30 minutos. Detener la reacción con 50 l/pocillo de 2N H2SO4. Mida la absorbancia a 450 nm con un lector de placas en un plazo de 30 minutos. Genere una curva estándar trazando la absorbancia frente a la concentración logarítmica y ajuste un modelo logístico de 4 parámetros (4PL) o de 5 parámetros. Calcule las concentraciones de las muestras interpolando a partir de la curva estándar. Las curvas aceptables tienen un R² > 0,98 y concentraciones estándar retrocalculadas entre el 70 y el 130 % de los valores esperados.
Aplicación del mundo real
Un ELISA sándwich para TNFα humano en suero de paciente utiliza un anticuerpo de captura monoclonal y un anticuerpo de detección policlonal. El ensayo tiene un rango de detección de 15 a 1000 pg/ml con un límite de cuantificación de 20 pg/ml. El suero de pacientes con artritis reumatoide muestra niveles de TNFα de 85 ± 32 pg/ml (n = 24) en comparación con 12 ± 7 pg/ml en controles sanos, lo que confirma que el TNFα es un biomarcador de inflamación y respalda las decisiones terapéuticas anti-TNFα.
