La fijación es el primer y más crítico paso en la preservación del tejido. Detiene la descomposición celular, estabiliza las macromoléculas y endurece el tejido para su posterior procesamiento y seccionamiento. La calidad de cada técnica posterior (tinción H&E, IHC, análisis molecular) depende de una fijación adecuada y adecuada.
Objetivos de fijación
Los objetivos principales de la fijación son prevenir la autolisis (autodigestión por enzimas intracelulares) y la putrefacción (descomposición bacteriana); preservar la morfología del tejido lo más cerca posible del estado de vida; endurecer el tejido para cortarlo sin distorsión; estabilizar componentes celulares (proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos) para la tinción; y hacer que las células sean permeables a colorantes y anticuerpos. Ningún fijador por sí solo logra todos los objetivos de manera óptima; la elección depende de la aplicación posterior prevista.
Química de formalina
La formalina tamponada neutra (NBF) al 10 % es el fijador universal en histopatología. La formalina comercial es una solución acuosa al 37 % de gas formaldehído; el NBF al 10 % es una dilución 1:10 (3,7 % formaldehído). El tampón neutro (fosfato de sodio monobásico y dibásico, pH 7,0-7,2) previene la formación de ácido fórmico (que causa el pigmento ácido de hematina) y mantiene condiciones óptimas de reticulación.
El formaldehído reticula proteínas formando puentes de metileno (-CH2-) entre grupos amino adyacentes, particularmente el grupo épsilon-amino de la lisina y los grupos amida de los péptidos. Esto crea una red de gel tridimensional que estabiliza la estructura del tejido. La reticulación depende de la temperatura: avanza aproximadamente dos veces más rápido a 37 °C que a temperatura ambiente. La fijación de rutina a temperatura ambiente requiere de 6 a 24 horas para biopsias pequeñas y de 24 a 48 horas para muestras más grandes. La regla estándar es 1 hora por mm de espesor de tejido.
Factores que afectan la fijación
El volumen del fijador debe ser al menos de 10 a 20 veces el volumen del tejido. Un volumen inadecuado agota el fijador antes de que se complete la penetración. Espesor del tejido: las secciones no deben tener más de 4-5 mm de espesor para una penetración adecuada; Las secciones más gruesas no se fijan bien en el centro. Temperatura: una temperatura más alta acelera la fijación pero aumenta la autólisis antes de que penetre el fijador; La temperatura ambiente es óptima para el uso rutinario. Agitación: la rotación suave mejora la circulación fijadora alrededor de la muestra. Retraso hasta la fijación: se deben minimizar el tiempo de isquemia caliente (tiempo desde el pinzamiento vascular hasta la extracción de la muestra) y el tiempo de isquemia fría (tiempo desde la extracción hasta la fijación). La isquemia fría prolongada degrada el ARN, las proteínas y las fosfoproteínas (lo que afecta a la IHC, en particular a los marcadores ER y fosfoespecíficos).
Tipos de fijadores
Fijadores (aldehídos) de reticulación: formaldehído, glutaraldehído (para EM), glioxal (una alternativa menos tóxica). El glutaraldehído proporciona una conservación superior de la ultraestructura, pero penetra lentamente y provoca más entrecruzamiento, lo que puede enmascarar los antígenos para la IHC.
Fijadores coagulantes: etanol, metanol, acetona. Estos precipitan las proteínas al alterar las capas de hidratación en lugar de entrecruzarlas. Conservan la actividad enzimática y los ácidos nucleicos, pero provocan una mayor contracción y endurecen el tejido rápidamente. La fijación con alcohol se utiliza para PCR y pruebas moleculares.
Fijadores combinados: la solución de Bouin (ácido pícrico, formaldehído, ácido acético) proporciona un excelente detalle nuclear y se utiliza para tejidos endocrinos, biopsias testiculares y biopsias gastrointestinales. El fijador B5 (cloruro de mercurio, formaldehído) se usó históricamente para los ganglios linfáticos, pero ahora rara vez se usa debido a la toxicidad del mercurio. El formol de zinc es una alternativa sin mercurio para la conservación del antígeno linfoide.
Alternativas sin reticulación: los fijadores moleculares (PAXgene, HOPE) conservan los ácidos nucleicos y las proteínas para el análisis molecular, pero proporcionan una morfología menos óptima que la formalina. Se utilizan principalmente en biobancos y entornos de investigación.
Procesamiento posterior a la fijación
Después de la fijación, las muestras se transfieren a etanol al 70% para su almacenamiento si se retrasa el procesamiento. Los tejidos pueden permanecer en etanol al 70% durante semanas sin efectos adversos. El almacenamiento prolongado en formalina (>72 horas) provoca una fijación excesiva que aumenta el enmascaramiento del antígeno y la fragmentación del ADN. Para una conservación a largo plazo, el tejido fijado en formalina se puede transferir a etanol después de 24 a 48 horas.
Control de calidad
La fijación se controla a través de la frescura del fijador (las soluciones se cambian periódicamente), tiempo de fijación (documentado en la solicitud), apariencia (el tejido bien fijado es firme y uniformemente pálido) y calidad de la tinción posterior (la mala fijación se manifiesta como detalles nucleares deficientes, palidez o efectos de borde en H&E). Los programas de garantía de calidad incluyen una revisión periódica de los indicadores de adecuación de la fijación.
