La microscopía de fluorescencia detecta la emisión de luz de los fluoróforos en longitudes de onda más largas que la longitud de onda de excitación. Permite la visualización altamente específica de múltiples objetivos moleculares simultáneamente en la misma sección de tejido. La microscopía confocal amplía las imágenes de fluorescencia al rechazar la luz desenfocada, produciendo secciones ópticas nítidas a través de muestras gruesas.
Principios de fluorescencia
Un fluoróforo absorbe fotones en una longitud de onda de excitación específica, elevando los electrones a un estado de mayor energía. Cuando el electrón vuelve a su estado fundamental, emite un fotón a una longitud de onda más larga (de menor energía); esta diferencia es el desplazamiento de Stokes. Un microscopio de fluorescencia utiliza una fuente de luz (arco de mercurio, xenón, LED o láser), un filtro de excitación que transmite solo la longitud de onda de excitación, un espejo dicroico que refleja la luz de excitación y transmite la luz de emisión, y un filtro de emisión que pasa solo la longitud de onda de emisión al detector.
Los fluoróforos comúnmente utilizados en el análisis de tejidos incluyen tintes DAPI (ADN, azul), FITC (verde), TRITC (rojo) y Alexa Fluor (brillo y fotoestabilidad mejorados). Los puntos cuánticos son nanocristales semiconductores con espectros de emisión de tamaño ajustable, lo que permite la multiplexación con una única fuente de excitación.
Inmunofluorescencia en tejido
Inmunofluorescencia directa utiliza un anticuerpo primario conjugado directamente con un fluoróforo. La inmunofluorescencia indirecta utiliza un anticuerpo primario no marcado detectado por un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo; la amplificación de la señal de múltiples secundarios por primario aumenta la sensibilidad.
La inmunofluorescencia en tejido fijado con formalina e incluido en parafina requiere una recuperación de antígenos idéntica a la IHC cromogénica. Las secciones congeladas a menudo producen una fluorescencia más fuerte porque la fijación no entrecruza los antígenos. La autofluorescencia de la lipofuscina, la elastina y los glóbulos rojos puede interferir; el uso de filtros de banda estrecha o de separación espectral minimiza esto.
La inmunofluorescencia múltiple (mIF) utiliza ciclos de tinción secuenciales, amplificación de la señal de tiramida (TSA) o imágenes espectrales para detectar de 6 a 12 marcadores en una sola sección. Esto permite una caracterización detallada del microambiente tumoral, incluidos subconjuntos de células inmunitarias, expresión de moléculas de puntos de control y relaciones espaciales.
Microscopía confocal
La microscopía confocal utiliza una apertura estenopeica en la ruta de emisión que bloquea la luz desenfocada. Sólo la luz del plano focal llega al detector, produciendo una sección óptica de aproximadamente 0,5-1,0 µm de espesor. Al escanear el láser a través de la muestra y recolectar secciones ópticas secuenciales (pilas z), es posible la reconstrucción tridimensional de las estructuras del tejido.
La microscopía confocal de barrido láser (LSCM) utiliza un rayo láser enfocado que escanea punto por punto la muestra. Proporciona la más alta resolución y flexibilidad para imágenes multicanal. La microscopía confocal de disco giratorio utiliza un disco giratorio con miles de poros, lo que captura imágenes más rápido con menos fotoblanqueo, ideal para obtener imágenes de células vivas.
Microscopía multifotónica
La microscopía multifotónica (de dos fotones) utiliza luz láser infrarroja donde dos fotones de menor energía se combinan para excitar un fluoróforo. Esto permite una penetración más profunda en el tejido (hasta 1 mm), una fototoxicidad reducida y un corte óptico intrínseco sin orificios. Se utiliza para obtener imágenes intravitales de estructura tisular y comportamiento celular en animales vivos.
Aplicaciones en Histopatología
La inmunofluorescencia es el método de detección estándar en patología renal (nefropatía por IgA, nefritis lúpica), dermatopatología (enfermedades ampollosas) y neuropatología (enfermedad de Alzheimer: colocalización de beta-amiloide y tau). La microscopía confocal permite un análisis detallado de la arquitectura del tejido en tres dimensiones. Multiplex IF se utiliza cada vez más en la investigación de inmunoterapia para mapear la distribución de las células inmunitarias y los patrones de expresión de PD-L1 para el desarrollo de biomarcadores predictivos.
Limitaciones
Los fluoróforos se fotoblanquean (pierden fluorescencia permanentemente) con excitación prolongada: use medios de montaje que no se decoloren y minimice la exposición a la luz. La autofluorescencia es un problema particular en el tejido fijado con formalina que contiene lipofuscina (común en el tejido envejecido, cardíaco y hepático); la desmezcla espectral o el pretratamiento con fotoblanqueo pueden ayudar. La obtención de imágenes confocales es más lenta que la de campo amplio y requiere equipo y capacitación especializados.
