Después de la amplificación por PCR o la digestión con enzimas de restricción, el ADN debe purificarse para eliminar enzimas, cebadores, nucleótidos, sales y componentes del tampón antes de las aplicaciones posteriores. Dos métodos relacionados cubren la mayoría de las necesidades de purificación.

Purificación de PCR

La purificación de PCR elimina cebadores, dNTP, polimerasas y sales de una reacción de amplificación. La mayoría de los kits comerciales utilizan una membrana de sílice en una columna de espín: el ADN se une a la membrana en presencia de una alta concentración de sales caotrópicas, los contaminantes pasan a través, y el ADN se eluye en un tampón de baja concentración salina (típicamente Tris 10 mM o agua).

El protocolo típico: añada tampón de unión (que contiene clorhidrato de guanidina o caótropo similar) directamente a la reacción de PCR, cargue en la columna, centrifugue, lave con tampón de lavado basado en etanol, centrifugue nuevamente, y eluya en 20–50 µL. La recuperación es típicamente del 60–90%.

La purificación de PCR es rápida (5–10 minutos) y funciona para fragmentos >100 pb. No elimina dímeros de cebadores o productos no específicos de tamaño similar — solo los cebadores en exceso y fragmentos pequeños que pasan a través de la columna.

Extracción de Gel

La extracción de gel aísla una banda específica de ADN de un gel de agarosa, eliminando todos los demás fragmentos de ADN, incluidos dímeros de cebadores y productos de cebado incorrecto. La banda deseada se excisa bajo luz UV usando un bisturí limpio, y la agarosa se disuelve en una solución de sal caotrópica a 50–60 °C. La agarosa fundida se pasa luego a través de una columna de sílice como en la purificación de PCR.

Consideraciones clave:

• Minimice el tiempo de exposición a UV para prevenir daño al ADN (use UV de 365 nm en lugar de 302 nm si está disponible).
• Corte lo más cerca posible de la banda para minimizar el volumen de agarosa.
• El paso de disolución requiere suficiente tampón — típicamente 3 volúmenes por volumen de gel.
• El rendimiento disminuye para fragmentos >10 kb; incubar el gel disuelto a temperatura ambiente en lugar de en columna mejora la recuperación de fragmentos grandes.

Limpieza de ADN por Precipitación

La precipitación con etanol es una alternativa tradicional que no requiere kits. Añada 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol al 100% frío, incube a −20 °C o −80 °C, centrifugue a máxima velocidad durante 15–30 minutos, lave con etanol al 70%, seque al aire y resuspenda. Este método funciona para cualquier tamaño de fragmento pero toma más tiempo y no elimina dNTP tan eficientemente como las columnas de sílice.

Control de Calidad

Después de la purificación, mida la relación A₂₆₀/A₂₈₀ para verificar la pureza (idealmente 1.8–2.0). Corra una alícuota en un gel para verificar que la banda esté intacta y tenga el tamaño correcto. Para clonación, el tampón de elución debe ser compatible con las enzimas posteriores — eluya en agua o Tris 10 mM (no EDTA si la ligación es el siguiente paso).