La purificación GST-tag utiliza proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST) inmovilizadas en agarosa-glutatión para purificar proteínas recombinantes de sistemas de expresión o para capturar e identificar interacciones proteína-proteína a partir de lisados celulares.
Principio
La proteína GST de 26 kDa de Schistosoma japonicum se fusiona con la proteína diana. La GST se une al glutatión (GSH, γ-glutamil-cisteinil-glicina) inmovilizado en perlas de agarosa con alta afinidad (K_d ≈ 0.1 µM). La proteína de fusión se captura de lisados crudos, se lava extensamente y se eluye con glutatión reducido 10–20 mM en condiciones no desnaturalizantes. Para estudios de interacción, la proteína de fusión GST inmovilizada sirve como cebo para capturar proteínas interactuantes de un lisado, que luego se identifican mediante Western blot o espectrometría de masas.
Resinas de Glutatión
La agarosa-glutatión consiste típicamente en perlas de agarosa reticuladas con glutatión acoplado a través del átomo de azufre. La capacidad de unión es de 5–15 mg de proteína de fusión GST por mL de resina. El glutatión reducido se utiliza como eluyente competitivo. Se requiere prehidratación y equilibrado en PBS o tampón similar (pH 7.3–8.0) antes de su uso. Las perlas magnéticas de glutatión permiten purificaciones rápidas en tubos de microcentrífuga para estudios de interacción a pequeña escala.
Expresión y Lisis
Las proteínas de fusión GST se expresan en E. coli BL21(DE3) a partir de vectores pGEX (GE Healthcare), que incluyen un promotor tac inducible con IPTG. La expresión a 18–25 °C durante la noche mejora la solubilidad de dianas difíciles. La lisis en PBS (NaCl 140 mM, KCl 2.7 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 1.8 mM, pH 7.3) con Triton X-100 al 1% o Tween-20 al 0.1% reduce la unión inespecífica. DTT (1–5 mM) mantiene la GST en su forma activa reducida. Los inhibidores de proteasa y DNasa/RNasa mejoran la calidad del lisado.
Protocolo de Purificación
Equilibrar la agarosa-glutatión con PBS. Incubar el lisado clarificado con la resina (batch: 30–60 min, 4 °C; columna: flujo por gravedad). Lavar con 20 volúmenes de PBS más Triton X-100 al 0.1%. Eluir con glutatión reducido 10 mM en Tris-HCl 50 mM pH 8.0. Recoger fracciones de 0.5 mL. Dializar la proteína eluida para eliminar el glutatión para aplicaciones posteriores. Eliminar la etiqueta GST mediante corte con trombina o proteasa PreScission en un sitio de reconocimiento diseñado, seguido de un paso sustractivo con agarosa-glutatión para capturar GST libre y fusión no cortada.
Protocolo de Purificación para Interacciones
Inmovilizar 50–200 µg de cebo de fusión GST en 25–50 µL de agarosa-glutatión. Incubar con lisado celular (0.5–2 mg de proteína total) en tampón de unión (PBS + NP-40 al 0.1%) durante 1–2 horas a 4 °C con rotación. Lavar 3–5 veces con tampón de unión. Eluir con tampón de muestra SDS 2× y analizar mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie o Western blot. Incluir perlas solo con GST como control negativo para identificar proteínas que se unen inespecíficamente a GST o a la resina. La preincubación con glutatión competidor (10 mM) demuestra competencia específica.
Ventajas y Limitaciones
La etiqueta GST a menudo mejora la expresión y solubilidad de su pareja de fusión, lo que la hace valiosa para proteínas difíciles. La elución con glutatión es suave y preserva la actividad proteica. El gran tamaño (26 kDa) puede, sin embargo, interferir con algunos ensayos funcionales, lo que obliga a eliminar la etiqueta. La dimerización de GST puede causar oligomerización no deseada de proteínas de fusión. La etiqueta es ideal para estudios de interacción de captura por afinidad pero menos adecuada si la adición de 26 kDa al peso molecular es problemática para el trabajo estructural.
