El cribado de alto rendimiento (HTS) es un proceso automatizado que evalúa grandes cantidades de compuestos contra dianas biológicas para identificar puntos de partida para el descubrimiento de fármacos o la investigación en biología química. Una campaña de HTS bien diseñada integra desarrollo de ensayos, automatización, análisis de datos y validación de aciertos.
Desarrollo de Ensayos
La base de cualquier campaña de HTS es un ensayo robusto y reproducible. El ensayo debe medir una actividad biológica específica en un formato adecuado para automatización y miniaturización. Los ensayos bioquímicos utilizan proteínas purificadas para medir la inhibición enzimática, la unión a receptores o las interacciones proteína-proteína. Los ensayos basados en células miden viabilidad, expresión de genes reporteros o cambios fenotípicos.
Los parámetros clave en el desarrollo de ensayos incluyen la relación señal-ruido, la relación señal-fondo y el factor Z, que cuantifica la calidad del ensayo para HTS. Un factor Z superior a 0.5 indica un ensayo excelente. El coeficiente de variación debe ser bajo, típicamente por debajo del 10%.
La miniaturización de ensayos reduce el consumo de reactivos y aumenta el rendimiento. Los ensayos HTS modernos se realizan en placas de 384 o 1536 pocillos con volúmenes totales de 5 a 50 µL. Los ensayos homogéneos que no requieren pasos de lavado son preferidos por su rapidez y simplicidad.
Tecnologías de Detección
Las lecturas basadas en fluorescencia son las más comunes en HTS. La intensidad de fluorescencia, la polarización de fluorescencia, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y la FRET resuelta en el tiempo (TR-FRET) se utilizan ampliamente. Los ensayos de luminiscencia, incluyendo los ensayos reporteros basados en luciferasa de luciérnaga y la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), ofrecen alta sensibilidad y bajo fondo.
La tecnología AlphaScreen utiliza quimioluminiscencia basada en perlas y es particularmente útil para detectar interacciones biomoleculares. Los ensayos basados en absorbancia son simples y robustos pero menos sensibles. Los enfoques sin marcaje como la resonancia de plasmón superficial (SPR) y la espectrometría de masas pueden detectar la unión directamente sin marcadores fluorescentes.
Librerías de Compuestos
Las librerías de HTS típicamente contienen cientos de miles a millones de compuestos. Las librerías de diversidad buscan cubrir un amplio espacio químico, mientras que las librerías enfocadas se dirigen a familias de proteínas específicas como quinasas o GPCR. Las librerías de fragmentos contienen compuestos de bajo peso molecular para el cribado basado en fragmentos.
La calidad de la librería se evalúa por la pureza, estabilidad y propiedades fisicoquímicas de los compuestos. La regla de cinco de Lipinski guía las propiedades similares a fármacos: peso molecular por debajo de 500 Da, logP por debajo de 5, no más de 5 donantes de enlaces de hidrógeno y no más de 10 aceptores de enlaces de hidrógeno. Los compuestos de interferencia en ensayos pan (PAINS) se marcan como aciertos frecuentes que producen falsos positivos mediante mecanismos no específicos.
Automatización y Robótica
El HTS se basa en sistemas robóticos integrados que manejan el almacenamiento de placas, la dispensación de líquidos, la incubación, el lavado y la detección. Los lavadores de placas, los pipeteadores multicanal y los eyectores de gotas acústicas permiten el manejo preciso de líquidos a volúmenes de nanolitros. El control ambiental mantiene la temperatura, humedad y niveles de CO2 para ensayos basados en células.
El rendimiento del cribado se mide en placas por día o compuestos por semana. Una campaña típica de HTS de 100,000 compuestos en formato de 384 pocillos requiere aproximadamente 260 placas. Las plataformas de ultra-HTS pueden cribar más de 1 millón de compuestos por día.
Análisis de Datos y Selección de Aciertos
Los datos del cribado primario se normalizan y corrigen por variaciones placa a placa. El porcentaje de inhibición o actividad se calcula en relación con controles positivos y negativos. La puntuación Z mide el número de desviaciones estándar de la media de la placa. Los umbrales de selección de aciertos se establecen típicamente en 3 desviaciones estándar por encima de la media o en un porcentaje de inhibición específico.
La confirmación de aciertos implica volver a probar en el ensayo primario y evaluar la actividad dependiente de la concentración. Los contrados eliminan compuestos que interfieren con la tecnología de detección en lugar de con la diana. Los ensayos de selectividad evalúan la actividad contra dianas relacionadas. Los compuestos promiscuos se identifican por sus relaciones estructura-actividad planas y su actividad en múltiples ensayos no relacionados.
De Acierto a Líder y optimización de líderes
Los aciertos confirmados se someten a optimización de química medicinal para mejorar la potencia, selectividad y propiedades similares a fármacos. Los estudios de relación estructura-actividad (SAR) identifican los grupos funcionales clave responsables de la actividad. El perfilado ADME (absorción, distribución, metabolismo, excreción) evalúa las propiedades farmacocinéticas. Los estudios de eficacia in vivo en modelos animales validan el potencial terapéutico de los líderes optimizados.
