La cromatografía de afinidad por metales inmovilizados purifica proteínas recombinantes con etiqueta de polihistidina mediante unión a iones metálicos de transición inmovilizados (Ni²⁺ o Co²⁺) a través de los anillos de imidazol de las cadenas laterales de histidina y elución con imidazol o pH bajo.
Principio
Una etiqueta de polihistidina — típicamente de 6 a 10 residuos de histidina consecutivos — se fusiona al extremo N o C de la proteína recombinante. La cadena lateral de imidazol de la histidina se coordina con iones metálicos divalentes quelados (Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺) inmovilizados en un soporte cromatográfico mediante quelantes de ácido nitrilotriacético o ácido iminodiacético. Ni-NTA (ácido nitrilotriacético) proporciona cuatro sitios de coordinación al ion Ni²⁺, dejando dos sitios disponibles para la unión de histidina. La interacción es reversible: el imidazol (20–500 mM) desplaza competitivamente la etiqueta de histidina, o el pH bajo (4.5–5.5) protona las cadenas laterales de histidina, interrumpiendo la coordinación metálica.
Tipos de Resina
Agarosa Ni-NTA (Qiagen, Thermo Fisher) es la resina IMAC más utilizada. La capacidad de unión es típicamente de 5–10 mg de proteína con etiqueta 6×His por mL de resina sedimentada. Ni-Sepharose (GE Healthcare) ofrece caudales más altos para aplicaciones de FPLC. TALON (Clontech/TaKaRa) utiliza resina de Co²⁺-carboximetilaspartato, proporcionando mayor especificidad con menor unión inespecífica que Ni-NTA, a costa de una menor capacidad. Las perlas magnéticas (Dynabeads His-Tag, MagnaHis) permiten la purificación en lote a partir de pequeños volúmenes. Las resinas de alta capacidad (hasta 40 mg/mL) están disponibles para purificación preparativa.
Tampones
Tampón de lisis/carga: Tris o fosfato 20–50 mM pH 7.5–8.0, NaCl 300–500 mM (suprime interacciones iónicas), imidazol 10–20 mM (reduce la unión inespecífica). Tampón de lavado: misma composición con imidazol 20–40 mM. Tampón de elución: imidazol 200–500 mM o gradiente de pH hasta 4.5. La concentración de NaCl es crítica — menor sal aumenta la unión inespecífica de proteínas ácidas. Aditivos como DTT 1 mM o TCEP previenen la oxidación de cisteínas superficiales. Para proteínas de membrana, se pueden incluir detergentes al 0.1–1% compatibles con IMAC (DDM, CHAPS, digitonina).
Protocolo
Lisar células en tampón de lisis con inhibidores de proteasa. Clarificar por centrifugación (20,000 g, 30 min) y filtración (0.45 µm). Equilibrar la resina con 5 volúmenes de tampón de lisis. Incubar el lisado clarificado con la resina (modo batch: 30 min rotando a 4 °C, o modo columna: cargar a 0.5–1 mL/min). Lavar con 10–20 volúmenes de columna de tampón de lavado hasta que la línea base UV se estabilice. Eluir con 5–10 volúmenes de tampón de elución, recogiendo fracciones. Analizar fracciones mediante SDS-PAGE y Western blot o ensayo de Bradford.
Colocación y Corte de la Etiqueta
La etiqueta 6×His puede colocarse en cualquiera de los dos extremos. Las etiquetas N-terminales son más comunes y producen mayor expresión en E. coli, pero las etiquetas C-terminales reducen el riesgo de afectar las secuencias señal N-terminales. La etiqueta puede eliminarse incorporando un sitio de corte para proteasa TEV, trombina o Factor Xa entre la etiqueta y la proteína. El corte se realiza después de la elución, seguido de un paso IMAC sustractivo para eliminar la etiqueta cortada y la proteína no cortada.
Aplicaciones
La purificación His-tag/IMAC es el método de purificación de proteínas más utilizado en biología molecular. Funciona para proteínas solubles expresadas en E. coli, levaduras, células de insecto y células de mamífero. También purifica proteínas de membrana solubilizadas en detergentes, proteínas de cuerpos de inclusión purificadas en condiciones desnaturalizantes (urea 8 M o guanidina-HCl 6 M) y complejos proteicos mediante etiquetado secuencial de parejas interactuantes (co-IMAC). El pequeño tamaño de la etiqueta rara vez interfiere con la función proteica, lo que la hace ideal para captura por afinidad, estudios estructurales y ensayos enzimáticos.
