La microscopía es esencial en microbiología para visualizar microorganismos que son demasiado pequeños para verse a simple vista. Las diferentes técnicas de microscopía proporcionan distintos niveles de resolución, contraste e información estructural.
Microscopía óptica
La microscopía de campo claro es la forma más básica, en la que la luz pasa a través de una muestra teñida y el contraste lo proporcionan tintes como violeta cristal, azul de metileno o tinción de Gram. La microscopía de contraste de fase convierte las diferencias en el índice de refracción en diferencias de contraste, lo que permite la visualización de células vivas sin teñir y es ideal para observar la motilidad bacteriana, la división celular y las endosporas. La microscopía de campo oscuro utiliza un condensador especial para iluminar la muestra con luz oblicua, haciendo que los objetos parezcan brillantes sobre un fondo oscuro, y se utiliza para visualizar bacterias delgadas como Treponema pallidum.
Microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia utiliza fluorocromos (tintes fluorescentes) que emiten luz en longitudes de onda específicas cuando se excitan con una fuente de luz de longitud de onda más corta. DAPI tiñe el ADN (fluorescencia azul), FITC marca los anticuerpos (fluorescencia verde) y la rodamina marca las estructuras celulares (fluorescencia roja). La inmunofluorescencia utiliza anticuerpos conjugados con fluoróforos que se unen específicamente a antígenos diana, lo que permite la detección de patógenos (p. ej., Legionella, clamidia) y componentes celulares. El etiquetado GFP (proteína fluorescente verde) permite la visualización de la localización y la dinámica de las proteínas en las células vivas.
Microscopía electrónica
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) pasa un haz de electrones a través de una sección ultrafina de la muestra, logrando una resolución de hasta 0,1 nm y permitiendo la visualización de partículas virales, estructuras celulares internas y complejos proteicos; las muestras requieren fijación, inclusión, corte y tinción con metales pesados (acetato de uranilo, tetróxido de osmio). La microscopía electrónica de barrido (SEM) explora un haz de electrones a través de la superficie de una muestra, detectando electrones secundarios para producir una imagen topográfica tridimensional con una resolución de 1 a 10 nm, y se utiliza para visualizar estructuras superficiales bacterianas, biopelículas y comunidades microbianas.
Microscopía confocal
La microscopía confocal utiliza una apertura estenopeica para eliminar la luz desenfocada, generando secciones ópticas nítidas a través de una muestra gruesa. Permite la reconstrucción tridimensional de biopelículas microbianas, secciones de tejido y estructuras intracelulares. La microscopía confocal de barrido láser (LSCM) permite obtener imágenes multicanal con diferentes fluoróforos simultáneamente.
Preparación de la muestra
Se prepara una preparación húmeda colocando una gota de cultivo líquido en un portaobjetos para observar los microorganismos vivos y su motilidad. Los frotis fijos implican fijar bacterias con calor o metanol en un portaobjetos y teñirlas para su visualización bajo microscopía de campo claro. La tinción negativa utiliza tinta china o nigrosina para teñir el fondo, dejando las células no teñidas visibles como áreas claras, lo cual es útil para la visualización de la cápsula. La tinción de Gram es la tinción diferencial más importante en bacteriología, clasificando las bacterias en Gram positivas o Gram negativas.
Resolución y ampliación
El límite de resolución de la microscopía óptica es de aproximadamente 0,2 µm (límite de difracción de Abbe), determinado por la longitud de onda de la luz y la apertura numérica del objetivo. El aumento máximo útil para microscopía óptica es de aproximadamente 1000-1500x. La microscopía electrónica logra una resolución mucho mayor debido a la longitud de onda más corta de los electrones (0,0037 nm a 100 kV).
