La secuenciación de próxima generación (NGS) abarca un conjunto de tecnologías de secuenciación modernas que pueden secuenciar millones de fragmentos de ADN en paralelo, lo que permite secuenciar genomas completos de forma rápida y asequible. Plataformas como Illumina, Ion Torrent y PacBio dominan el campo.
Cómo funciona NGS (plataforma Illumina)
- Preparación de la biblioteca
El ADN se fragmenta en trozos pequeños, normalmente de 200 a 600 pares de bases. Los adaptadores (secuencias cortas conocidas) se ligan a ambos extremos de cada fragmento. Estos adaptadores permiten que los fragmentos se unan a la celda de flujo y sirvan como sitios de cebado para la secuenciación.
- Generación de clústeres
La biblioteca se carga en una celda de flujo cuya superficie está recubierta con oligonucleótidos complementarios. Cada fragmento se une a la celda de flujo y se somete a una amplificación puente: el fragmento se dobla, se sintetiza una nueva hebra y el proceso se repite, creando un grupo de miles de copias idénticas de cada fragmento.
- Secuenciación por síntesis
Los nucleótidos marcados fluorescentemente se hacen fluir sobre la celda de flujo uno a la vez. Cada nucleótido tiene un terminador reversible que permite agregar solo una base por ciclo. Después de cada ciclo, se obtienen imágenes de la fluorescencia para identificar qué base se agregó a cada grupo.
- Análisis de datos
Se generan millones de lecturas de secuenciación. Estas lecturas se alinean con un genoma de referencia o se ensamblan de novo. Las herramientas bioinformáticas identifican variantes genéticas, niveles de expresión génica o modificaciones epigenéticas según la aplicación.
- Aplicaciones
NGS se utiliza para secuenciación del genoma completo, paneles de genes específicos, secuenciación de ARN, análisis epigenético y metagenómica, entre muchas otras aplicaciones.
Flujo de trabajo práctico de preparación de la biblioteca NGS
Comience con 10–100 ng de ADN genómico de alta calidad (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Fragmentar el ADN utilizando un sonicador Covaris o fragmentación enzimática para lograr un tamaño objetivo de 200 a 600 pb. Realice la reparación final para generar extremos romos, seguido de A-tailing (adición de una sola adenosina a los extremos 3’) utilizando el fragmento de Klenow. Ligar adaptadores compatibles con Illumina que contienen un saliente de 5’ T a los fragmentos de cola A utilizando ADN ligasa T4. Purifique los productos de ligadura utilizando perlas AMPure XP en una proporción de 0,8 x perla-muestra para eliminar los adaptadores no ligados. Amplifique la biblioteca ligada al adaptador mediante PCR durante 8 a 12 ciclos utilizando cebadores complementarios a las secuencias del adaptador; Incluye códigos de barras únicos de doble índice para multiplexación de muestras. Limpie el producto de PCR con perlas AMPure XP en una proporción de 0,8 ×. Evalúe la calidad y cantidad de la biblioteca utilizando un bioanalizador o TapeStation (distribución de tamaño esperada: 250–700 pb) y cuantificación fluorométrica Qubit. Normalice las bibliotecas a 4 nM, agrupe equimolarmente y desnaturalice con NaOH 0,2 N antes de cargarlas en la celda de flujo de Illumina a 1,8 pM para una secuenciación de extremos emparejados de 2 × 150 pb. Supervise la densidad del clúster (objetivo: 800–1200 K/mm² para HiSeq 4000) y las puntuaciones Q30 (>80 % para ejecuciones de alta calidad). Demultiplexe la salida usando bcl2fastq y evalúe la calidad por base con FastQC. Recorte adaptadores y bases de baja calidad usando Trimmomatic antes de la alineación.
Aplicación del mundo real
En la genómica clínica del cáncer, se utiliza un panel NGS específico que cubre 500 genes relacionados con el cáncer para perfilar la biopsia del tumor de un paciente. La preparación de la biblioteca a partir de 50 ng de ADN FFPE produce el 94 % de los objetivos cubiertos a >100 × de profundidad. El análisis identifica una mutación KRAS G12C (0,46 VAF) y una amplificación de EGFR, lo que guía la selección del tratamiento con un inhibidor de MEK.
