Descripción general
La identificación de proteínas mediante espectrometría de masas es la piedra angular de la proteómica. El flujo de trabajo fundamental implica digerir proteínas en péptidos utilizando una proteasa como la tripsina, medir las masas de los péptidos intactos (MS1) y luego fragmentar los péptidos seleccionados para generar espectros de masas en tándem (MS/MS) que revelan su secuencia de aminoácidos. Los espectros resultantes se comparan con espectros teóricos derivados de bases de datos de secuencias de proteínas para asignar identidades. Este enfoque ascendente o escopeta es altamente escalable y puede identificar miles de proteínas a partir de mezclas complejas en un solo experimento.
Métodos
La huella digital de masas de péptidos (PMF) identifica proteínas haciendo coincidir la lista de masas de péptidos medidas experimentalmente con las masas de péptidos teóricas calculadas a partir de una base de datos. PMF funciona mejor para mezclas de proteínas simples o proteínas purificadas separadas mediante técnicas como SDS-PAGE. Identificación por MS en tándem (MS/MS) fragmenta péptidos individuales para producir espectros informativos de secuencia. Los motores de búsqueda comparan las series de iones de fragmentos observados (principalmente iones b e y) con las series predichas de péptidos candidatos. La secuenciación de novo infiere la secuencia peptídica directamente del espectro cuando no se encuentra ninguna coincidencia en la base de datos, utilizando las diferencias de masa entre iones de fragmentos consecutivos para derivar la secuencia.
Protocolo práctico
Un flujo de trabajo típico de identificación de proteínas comienza con una mezcla de proteínas, como un complejo inmunoprecipitado, una banda de gel SDS-PAGE o una fracción electroforesis en gel capilar. Las proteínas se reducen con ditiotreitol (DTT) 10 mM a 56 °C durante 30 minutos, se alquilan con yodoacetamida 55 mM en la oscuridad durante 30 minutos y se digieren durante la noche con tripsina en una proporción de enzima a sustrato de 1:50 a 37 °C. Los péptidos resultantes se desalan utilizando C18 ZipTips y se cargan en un sistema nanoLC acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap. El instrumento funciona en modo de adquisición dependiente de los datos: un escaneo MS1 completo de 350 a 1600 m/z con una resolución de 70 000 identifica los 15 iones precursores más intensos, que se aíslan y fragmentan secuencialmente mediante disociación colisional (HCD) de mayor energía al 27 % de energía de colisión normalizada para producir espectros MS/MS. Los espectros de fragmentos se buscan en una base de datos de proteínas utilizando Mascot o SEQUEST. Cada coincidencia de péptido-espectro se califica en función de la correlación entre los iones de fragmentos experimentales y las series teóricas de iones b e y. Una búsqueda de señuelo objetivo estima el FDR y las coincidencias se filtran al 1% de FDR tanto en niveles de péptidos como de proteínas. La agrupación de proteínas colapsa los péptidos que se asignan a múltiples proteínas según la parsimonia. Un ejemplo de aplicación en el mundo real: la identificación de la composición del complejo de poros nucleares humanos mediante fraccionamiento bioquímico y espectrometría de masas reveló más de 30 nucleoporinas, muchas de ellas no caracterizadas previamente, lo que proporciona una imagen molecular completa del transporte nuclear. Otra aplicación es la identificación bacteriana mediante MALDI-TOF MS en microbiología clínica, donde los perfiles de proteínas ribosómicas sirven como huellas dactilares taxonómicas para la identificación a nivel de especie en cuestión de minutos en lugar de días.
Aplicaciones
La identificación de proteínas se aplica en toda la biología molecular y la investigación clínica. Confirma la identidad de las proteínas purificadas obtenidas mediante extracción y purificación de proteínas, caracteriza componentes de experimentos de proteómica y espectrometría de masas e identifica complejos de proteínas copurificados con una proteína de cebo. En microbiología, se utiliza para identificar especies bacterianas mediante proteotipado basado en espectrometría de masas, complementando los enfoques genómicos.
