Los ensayos de genes reporteros son una piedra angular de la biología molecular para estudiar la regulación génica. Un gen reportero codifica una proteína cuya actividad es fácilmente medible, y se coloca bajo el control de un promotor o elemento regulador de interés.
Reporteros Comunes
- Luciferasa de luciérnaga (de Photinus pyralis): cataliza la oxidación de D-luciferina, produciendo luz a 560 nm. La señal se mide con un luminómetro. Tiene un rango dinámico muy alto (7–8 órdenes de magnitud) y prácticamente sin fondo en células de mamífero.
- Luciferasa de Renilla (de Renilla reniformis): utiliza coelenterazina como sustrato, emitiendo a 480 nm. Se usa comúnmente como reportero de control para normalización en ensayos de doble luciferasa.
- Proteína fluorescente verde (GFP): de Aequorea victoria, fluoresce a 509 nm cuando se excita a 395 nm. Las variantes cubren todo el espectro visible (CFP, YFP, RFP, mCherry). La fluorescencia puede medirse con fluorómetro, citómetro de flujo o microscopía, permitiendo análisis en células vivas y unicelulares.
- β-Galactosidasa (LacZ): escinde X-gal para producir un precipitado azul (colorimétrico) u ONPG para producir un producto amarillo (absorbancia a 420 nm). Simple y económica pero menos sensible que la luciferasa.
- SEAP (fosfatasa alcalina secretada): secretada al medio de cultivo, permitiendo muestreo repetido del mismo cultivo sin lisar células. Se mide mediante un sustrato quimioluminiscente.
- CAT (cloranfenicol acetiltransferasa): el reportero clásico, detectado por ELISA o ensayo radiactivo. Ahora ampliamente reemplazado por luciferasa y GFP.
Ensayos de Doble Luciferasa
Los ensayos de doble luciferasa utilizan luciferasa de luciérnaga y Renilla en la misma muestra. El promotor de prueba impulsa la luciferasa de luciérnaga, y un promotor constitutivo (ej., SV40, TK) impulsa la luciferasa de Renilla como control interno. Después de medir la luminescencia de luciérnaga, un reactivo la apaga y activa la luminescencia de Renilla. La relación luciérnaga/Renilla normaliza la eficiencia de transfección y el número celular.
Aplicaciones
Los ensayos reporteros se utilizan para:
- Mapear regiones promotoras y potenciadoras
- Estudiar la actividad de factores de transcripción
- Medir la activación de vías de señalización (ej., NF-κB, CREB, STAT)
- Seleccionar compuestos que modulan la expresión génica
- Monitorear la actividad de miRNA (reporteros de 3′ UTR)
- Cuantificar la eficiencia de transfección
